PCR扩增思维导图
PCR扩增
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思维导图大纲
PCR扩增思维导图模板大纲
20体系
SYBRGREEN 10ul + ddH2O 7ul + 引物F0.5ul,引物R 0.5ul
多少组引物配多少个EP管
新买的引物需要配置，在EP管上写的有/ 加水稀释10倍/然后就可以直接按照20ul体系加样
目的：在基因水平上看组间差异
步骤
1.配好的20体系引物先涡旋混匀再离心
2.加dd水稀释cDNA 4-5倍.
3.将配好的引物转移至孔板，然后将稀释后的cDNA也转移至孔板（第一次结合）
子主题 1
2份混合物（样品2份+引物2份）建议新手3份
每个孔引物量：18×2×1.1=39.6
cDNA:2×2×1.1=4.4
用排枪混匀，至少吹打20下，混匀时移液枪不要按到底即第二档，以免气泡
4.将孔板里面的双份体系再转入96/384孔板（移液枪不要按到底)
5.贴膜
手不要触摸膜/将孔板间的缝隙压平
6.仪器预冷,扩增
配平
2000r 4min 4℃
7.Q6
1.机器关闭时换96/384（黑色的按一下，然后压紧）
2.开机器（开关在后面），选择administer
3.打开quantstudio软件
检查是否连接
RUN 绿色√
4.设置程序
5.开始
选择倒三角
避免空转，记得放样品
如果样品已经放进去了，已经开始运行了，弱程序中断。则样品报废
6.导出
选择文件夹
导出后会有两个文件格式，只有EXCEL格式才能在自己的电脑上打开
7.分析——CT值是指扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的扩增循环数
CT值越大则含量越低 / 相对定量：测定一个样本中的基因序列与标准品中同一序列的相对变化eg mRNA表达量差异分析 siRNA效果分析
子主题 1
子主题 1
CT值 △CTmean （△CT平均值） △CT SE(△CT标准差)
内参基因：校正上样量，保证实验结果准确性
每块板都要有内参，不能两块板用一个内参
内参为单峰，否则数据存疑
溶解曲线：扩增后温度逐渐升高时荧光信号变化 / 单峰特异性好
注意
Q6迟到早退或超时超过30min会扣分
最后一个走才用关机
默认96孔板/384孔板用完后需要换回96孔板
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