分子生物学研究方法（上)思维导图
分子生物学研究方法（上)
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思维导图大纲
分子生物学研究方法（上)思维导图模板大纲
RNA操作技术
总RNA的提取
● 常用方法：异硫氰酸胍-苯酚提取法
● RNA提取的注意事项： 1.杜绝外源酶的污染：1.1 严格戴好手套，口罩；1.2 实验涉及的离心管，枪头，移液器杆，电泳槽，实验台面都要彻底处理；1.3 实验涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须保证Rnase-Free。2.阻止内源酶的活性：2.1 选择合适的匀浆方法；2.2 选择合适的裂解液；2.3 控制好样品的起始量。
● RNA质量的检测：OD260/OD280=1.8-2.0 ，表示RNA纯度较好；OD260/OD280<1.8，表示RNA中有蛋白质或苯酚
终点：蓝色出现
mRNA的纯化
● Promega Poly（AT） tract mRNA Isolation System分离Poly(A)RNA 将用生物素标记的Oligo （dT)与总RNA共温育；加入包被有抗生物素蛋白的微磁球；用磁场吸附Oligo(dT)-mRNA。
cDNA的合成
● cDNA 第一链的合成
● 反转录酶：依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶，有 5'--3'DNA 聚合酶活性。
● 合成 DNA 常用的引物： Oligo（dT）和随机引物。
● cDNA 第二链的合成
● RNaseH：将mRNA－cDNA 杂合双链中的 mRNA 链切割成很多的小片段； 大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ：以形成的小片段为引物，以第一链cDNA 为模板合成一段段互补的 cDNA 片段。 DNA 连接酶：合成的这些小cDNA片段被连接成一条链
cDNA文库的构建
● 从一定生长阶段的某种细胞或组织分离得到的总mRNA反转录成总cDNA，插入到克隆载体，然后再将cDNA重组子转移到宿主细胞中进行增殖。通过上述方法所获得的无性繁殖系即为cDNA文库。
基因文库的筛选
● 基因文库(gene library):包括基因组文库和cDNA文库
● 筛选方法：核酸杂交法，PCR筛选法，免疫筛选法
非编码RNA研究
● 高等真核生物基因组中，蛋白质编码区只占很小一部分，非蛋白质编码区占据基因组中绝大部分位置。而高等真核生物基因组中一半以上的DNA会转录为RNA，所以大部分RNA是不编码蛋白质的，这些RNA被统称为非编码RNA
● 可以从总RNA样品中去除rRNA和tRNA，再分离其他非编码RNA。
● 非编码RNA中有一类具有闭合环状结构的RNA分子，称cirRNA，利用它的这一特殊结构可单独将其分离出来。
重组DNA技术史
20世纪40年代：确定了遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质
20世纪50年代：提出了DNA的双螺旋结构模型和半保留复制
20世纪50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说
DNA基本操作技术
基因组DNA的提取
核酸提取的一般过程
破碎细胞(加入核酸酶抑制剂——防止核酸酶的作用)
破碎抽提核酸除去杂质
核酸的纯化
核酸凝胶电泳
种类：琼脂糖（agarose）凝胶电泳； 聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳可以回答两个问题 (一）目标DNA片段有没有? (二）目标DNA片段的浓度和纯度怎样?
原理：
带电颗粒在电场中将受到电场力的作用而发生泳动
电泳缓冲液中充满了离子，因而导电，DNA分子在pH 7- 8时带负电，因此在电场作用下向正极泳动。
琼脂糖凝胶中含有密集细小的孔洞，线状的DNA 分子可以通过
DNA分子越大，阻力越大，泳动越慢，经过一定时间泳动后将按大小排列成组“条带”。
聚合酶链式反应技术
一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，也称为 基因的体外扩增法。 在试管中建立反应，经过数小时后，能将极微量的目的 DNA扩增十万乃至千万倍。
PCR的基本原理
待扩增DNA片段经高温变性成为单链后，在低温（如 52℃）下与寡聚核苷酸引物退火，然后在中温下以每一条 单链为模板，由多聚酶催化延伸引物链，分别合成一条新 链。经过解链、退火和链延伸等多个循环反应，原DNA片 段就可得到大量扩增。
PCR的应用
科学研究：基因克隆；DNA测序；分析突变；基因重组；构建重组载体等
临床诊断：病原微生物的鉴定；人类遗传病的鉴定； 法医学标本鉴定等等
细菌转化
获得大量重组载体的拷贝。
感受态细胞：多数细菌在正常条件下仅能获取极少量的外源DNA，为了提高转化效率，必须对受体细菌进行一些物理或化学处理，这种经过处理的细胞被称作感受态细胞。
细菌转化常用的方法有：CaCl2法和电击法。
目的基因的筛选和鉴定方法
以载体特征进行筛选
以目的基因序列进行筛选
以目的基因的表达产物进行筛选
基因组DNA文库的构建
基因文库(gene library):包括基因组文库和 cDNA文库。
基因组文库
含有某种生物全部遗传信息的重组 DNA分子的克隆总体。
cDNA文库
从一定生长阶段的某种细胞或组织分离得到的总mRNA 反转录成总cDNA，插入到克隆载体，然后再将cDNA重组 子转移到宿主细胞中进行增殖。通过上述方法所获得的无性 繁殖系即为cDNA文库。
蛋白质与蛋白质组学技术思维导图模板大纲
蛋白质组学是蛋白质和基因组研究在形式和内容两方面的完美组合，该技术致力于研究某一物种、个体、器官、组织或细胞在特定条件、特定时间所表达的全部蛋白质图谱。
双向电泳技术
双向电泳技术是分离大量混合蛋白质组分的最有效方法。
技术依赖
蛋白质等电聚焦
不同等电点的蛋白质聚集在介质上不同的区域（等电点）从而被分离
SDS-聚丙烯酰胺凝胶双向电泳技术
由于去垢剂SDS带有大量负电荷，使蛋白质所带电荷量忽略不计，蛋白质在电场中的运动强度和距离完全取决于其相对分子质量
分离依据
相对分子质量、等电点
固相化PH梯度技术的意义
建立了稳定的可精确设定PH梯度，避免载体两性电介质向阴极漂移的缺点
增大了蛋白质上样量，提高了电泳结果的可重复性
荧光差异显示双向电泳技术
与传统2-DE相比的优势
克服传统的系统误差问题，提高实验结果的可重复性和可信度
例子
最小标记法的原理：用3种荧光染料对不同样本进行标记，混合标记样本，使用双向电泳在同一块胶上分离。
检测范围
低至25pg与多达五个数量级的蛋白质浓度变化给出线性反应
蛋白质质谱分析技术
使用
用质谱鉴定电泳分离后的蛋白质、鉴定蛋白质复合物组成和确定蛋白质翻译后修饰类型及位点等。
常用质谱
基质辅助的激光解析电离-飞行时间质谱（MALDI- TOF）
工作原理:见图P200图
一级质谱：将经蛋白质酶降解后的肽段照核质比及强度进行分析，形成肽指纹图谱
二级质谱：挑选一级质谱代表性的母离子峰以诱导碰撞解离方式打碎，再形成碎片指纹图谱
电喷雾质谱（ESI- MS）
基因克隆技术 思维导图模板大纲
RACE技术
cDNA末端快速扩增法是一项在已知cDNA序列的基础上克隆5’端或3’端缺失序列的技术
RAMPAGE技术
RAMPAGE技术是一种在全基因组范围内鉴定所有蛋白质编码基因和部分非编码RNA基因的转录起始位点，确定启动子的具体位置，并且能够高通量检测基因表达水平的方法。
Gateway大规模克隆技术
利用λ噬菌体进行位点特异性DNA片段重组，实现了不需要传统的酶切联接过程的基因快速克隆和载体间平行转移，为大规模克隆基因组注释的开放读码框提供了保障。
基因的图位克隆法
分离未知性状目的基因的一种好方法。
热不对称交错多聚酶链式反应克隆T-DNA插入位点侧翼序列
TAIL-PCR常用于扩增T-DNA插入位点侧翼序列，从而获得转基因植物插入位点特异性分子证据。
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