第四章 酶分子修饰思维导图
第四章 酶分子修饰知识梳理
树图思维导图提供 第四章 酶分子修饰 在线思维导图免费制作，点击“编辑”按钮，可对 第四章 酶分子修饰 进行在线思维导图编辑，本思维导图属于思维导图模板主题，文件编号是：1651fd58dcdf54fa243484dc429cbcd3
思维导图大纲
第四章 酶分子修饰思维导图模板大纲
定义
通过物理、化学、生物技术等方法，使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的稳定性、催化特性或其他方面性质的技术过程。
酶分子工程
依据酶的构效关系，在分子水平上实现酶的结构设计何操作的技术
分类
分子生物学水平
基因工程，DNA/RNA分子改造，获得化学结构更合理的酶蛋白
一级结构水平
天然酶分子，包括酶一级结构中氨基酸置换、 肽链切割、氨基酸侧链修饰
达到的目的
酶工程角度
提高催化效率
改变底物专一性
增强酶的稳定性
降低或消除酶的抗原性
酶学角度
研究酶的一级结构改变对高级结构的影响
酶活性中心必需氨基酸的种类和数目
酶分子拓扑学及寡聚酶的亚基结合状态
酶蛋白部分区域的构象
探究酶的结构与催化特性之间的关系
酶的作用机理何催化反应历程
原因
生理最适的催化条件与实际应用所需的条件不符
酶分子对热、酸、碱、有机溶剂的耐受性较差，容易失活或变性
酶在非生理条件下活力下降，天然酶抗原性显著，容易发生免疫反应
作用
改变酶的某些性质
增强酶的稳定性
创造天然酶所不具备的特性
提高酶的使用价值
扩大酶的应用范围
理论依据何思路
构效关系
酶的结构特点与酶催化特性之间的关系
修饰思路
引入修饰剂→修饰位点附近结构的变化→酶的空间结构改变→影响酶与底物结合→改变酶的催化特性
类型
理性设计
掌握酶的构效关系
找出关键结构
有针对性地改造
半理性设计
定向进化方法
以基因随机重组为手段
基于特定性状地筛选
反应的影响因素及条件
尽可能在酶稳定地条件下进行，尽量不破坏维持酶活性功能地必需基团
影响因素
酶功能基团反应性
功能基团pKa值的变化
微环境极性
氢键效应
静电效应
位阻效应
修饰剂的反应性
选择性
位阻效应
催化活性
与酶的相互作用
局部微环境极性
参数
反应时间
反应温度
pH
酶与修饰剂比例
防止酶过度修饰
离子强度
大分子结合修饰
采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，改变酶分子的空间构象，从而改变酶催化特性及其他性质的方法
过程
选择合适的修饰剂
一般选择溶解性好、生物相容性好、抗原性弱且无毒的聚合物
eg.聚乙二醇PEG、多糖及其衍生物
常用的大分子修饰剂
聚乙二醇衍生物
天然多糖及其衍生物
人工合成的聚合物
多肽、蛋白等
实例
PEG
性质
可溶于水及多种有机溶剂
毒性小，免疫原性低，生物相容性好
分子量范围宽，选择余地大
端基为羟基，便于活化及衍生化
关键步骤
PEG端羟基的活化
活化产物与酶侧链活性基团偶联
常用方法
三聚氢氯法
得到单链、双链PEG修饰得到的产物
醛基法
常用于选择性酶分子的N-末端-α-氨基
二硫键交换法
常用于选择性修饰酶分子表面的游离巯基
可利用吡啶硫酮的紫外吸收（343nm）在线监测反应进程
环氧法
琥珀酰亚胺法
选择性修饰氨基
可在pH7~10范围内修饰酶侧链赖氨酸氨基
右旋糖苷
性质
葡萄糖以α-1，6-糖苷键形成的多糖
水溶性和生物相容性较好
2，3-双羟基经氧化后可断裂为醛基
常用方法
溴化氰活化法
形成C N双键高活性中间体
双键与酶侧链基团偶联
高碘酸氧化法
C2-C3键断裂
延长连接臂，减小连接位阻
肝素
性质
由β-D-葡萄糖醛酸和N-乙酰/磺酰氨基葡萄糖形成重复二糖单位组成的多糖
弱酸性聚电解质
抗凝血作用，临床主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、血液透析等
常用方法
碳二亚胺活化法（-COOH的活化反应）
三聚氢氯法（-OH的活化）
对修饰剂进行活化
将修饰剂分子中的侧链或末端基团转化为高反应活性的基团
修饰剂与酶反应并偶联
活化的修饰剂与纯化的酶液混合，使修饰剂与酶反应、偶联
修饰酶分离纯化
采用透析、超滤、分子筛层析等分离方法将修饰酶分离纯化
作用
提高部分酶的催化效率（催化活性）
改变了酶的空间构想，有可能促使酶活性中心与底物更容易结合
位阻效应
增强酶的稳定性
水溶性大分子与酶结合，在酶分子外形成保护层，可以保护酶的空间构象
位阻效应
不溶性大分子与酶结合，形成固定化酶，亦提高酶的稳定性
位阻效应
半衰期（酶稳定性的表征）延长
降低或消除抗原性
大分子修饰后酶蛋白空间结构改变，酶蛋白与抗体之间特异性识别作用减弱，降低了酶蛋白与抗体的结合机率
屏蔽效应
PEG 修饰最显著
金属离子置换修饰
金属酶
含有一种或几种金属离子作为辅基的结合酶
特征
金属离子一般位于酶活性中心
与酶蛋白侧链特定集团以配位键结合
金属离子可直接参与催化作用
金属离子对酶活性和构象起稳定作用
纯化时仍保留着定量功能金属离子
区别金属酶与其他酶的重要特征之一
典型金属酶
α-淀粉酶：Ca2+/Mg2+/Zn2+
过氧化氢酶：Fe2+
漆酶：Cu2+
脲酶：Ni2+
固氮酶：Fe（II）和Mo（IV）
谷胱甘肽酶过氧化物酶：Se（IV）
刀豆脲酶
漆酶
把酶分子中的金属离子置换成另一种金属离子，使酶的催化特性发生改变的修饰方法
目的
了解金属离子在酶催化过程中的作用
阐明金属离子与催化机理之间的关系
操作过程
①向纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，与酶分子中的金属离子形成螯合物
如EDTA,IDA等常用螯合剂
②通过超滤、透析或分子筛层析等方法除去螯合物及多余的螯合剂
此时酶分子往往处于无活性状态
③往去除了金属离子的酶液中加入另一种金属离子溶液，使酶蛋白与新加入的金属离子结合
局限性
部分酶的活性中心与高价态金属相结合
部分酶蛋白与金属离子结合非常紧密
用一般的螯合剂很难将其中的金属除去
作用
阐明金属离子对酶催化的作用
除去金属离子的酶蛋白或置换修饰酶如果无活性，表明原先与酶结合的这种金属离子对酶的催化活性至关重要
改变酶的催化效率
eg.将Zn型α-淀粉酶置换成Ca型，活力可提高20%~30%
增强酶的稳定性
Fe-SOD置换成Mn-SOD后稳定性增强，对NaN3敏感性降低
改变酶的动力学特征
酰化氨基酸水解酶活性部位的Zn被Co置换后，酶的底物专一性（Km值）和最适pH都显著改变
侧链基团修饰
采用化学方法，使酶蛋白侧链基团发生改变，从而改变酶的特性
作用
研究各种基团在酶分子中的数量、作用
研究各种基团对酶的结构、特性和功能的影响
研究酶分子中必需基团的组成
研究某种基团对酶动力学性质的影响
改变酶结构、稳定性和催化特性
可修饰的侧链基团及反应类型
蛋白类酶的侧链基团
亲核性基团
氨基、巯基、羧基、羟基、胍基…
亲电性基团
苯环、杂环……
核酸类酶的侧链基团
核糖上的羟基
与糖链连接的磷酸基
碱基上的氨基、羟基
杂环自身
反应类型
酰基化
氨基的酰胺化 磺酰胺化
羟基的酯化
烷基化
氨基、巯基亲核取代或加成烷基化
苯环和杂环亲电取代烷基化
氧化还原
芳环取代
氨基修饰
酶分子中的氨基
非质子化的氨基具有很高的亲核反应活性
氨基的修饰反应
氨基易被某些修饰剂选择性修饰氨基修饰反应主要是酰胺化和N-烷基化等
琥珀酸酐修饰
丹磺酰氯修饰
N-末端氨基修饰，产物具有荧光性，可用于酶蛋白的末端分析
2，4-二硝基氟苯修饰
N-末端氨基修饰，取代反应，用于酶蛋白的末端分析
2，4，6-三硝基苯磺酸修饰
Lys氨基修饰，产物在420和360nm具有典型吸收峰，用于光谱定量
碘乙酸修饰
氮取代烷基化反应
磷酸吡哆醛修饰
亲核加成反应，修饰酶在325nm有最大吸收峰，用于光谱定量
异硫氰酸荧光素修饰
亲核加成，用于酶的荧光标记与检测
子主题 8
羧基修饰
酶分子中的羧基
羧基的修饰反应
碳二亚胺活性修饰
标准方法
比较温和的条件下活化羧基
先加成，后取代
氟硼酸三甲氧盐修饰
巯基修饰
酶分子中的巯基
来自半胱氨酸残基，以二硫键的形式存在
修饰反应
Ellman试剂修饰
最常用
副产物2-硝基-5-硫苯甲酸阴离子在412nm具有最大吸收峰，可用于巯基定量测定
二硫二吡啶修饰
副产物吡啶硫醇分子内重排生成吡啶硫酮，促使二硫键交换反应几乎不可逆的发生
有机汞化合物修饰
对氯汞苯甲酸对巯基有很高的专一性，修饰产物在250nm具有最大吸收，可定量测定巯基
2氯汞-4-硝基苯酚，修饰产物也可用于巯基定量分析
烷基化修饰
胍基的修饰
羟基的修饰
酚基的修饰
咪唑基的修饰
吲哚基的修饰
甲硫基的修饰
分子内交联
采用交联剂，在酶分子中对空间距离较近的两个氨基酸残基侧链基团之间，同时进行共价连接。
使酶分子局部结构刚性增强，使酶的空间构象变得更加稳定
青霉素酰化酶用葡聚糖二乙醛分子内交联后，55℃下半衰期延长9倍，最大反应速率不变
亲和修饰
某种试剂只作用于特定部位的某一基团，而不与这一部位之外的同类基团反应的修饰方法
原因
一般修饰剂通常能与多个同类基团反应
对某个特定基团的选择性修饰比较困难
基团专一性修饰
一种修饰剂只能与某种特定基团反应，而不能与其他基团反应
亲和标记试剂仅与邻近位置的基团发生反应，而不与其余位置的同类基团发生反应
亲核标记试剂的特点
位点专一性
具有与底物相似的结构
对酶活性部位具有高度亲和性
能共价修饰活性部位氨基酸残基
不可逆性
专一性修饰酶活性中心
使酶发生不可逆失活
亲和标记试剂符合条件
使酶不可逆失活前，与酶形成可逆复合物
修饰程度有限、定量的
结构类似物会干扰修饰，类似竞争性抑制
体积不能太大，会造成较大的空间位阻
产物应当足够稳定，便于表征和定量
亲和标记试剂类型
竞争性标记试剂 Ks型
根据底物结构设计，与底物结构相似的结合集团
有能与酶活性部位氨基酸侧链反应的活性基团
竞争、结合、修饰酶的活性部位，导致酶不可逆失活
定点定量修饰
底物、竞争性抑制剂及其他结构类似物具有干扰作用
自杀性标记试剂 Kcat型
根据酶催化过程设计，专一性很高
有酶的底物性质，还有一个潜在的反应基团
受酶催化而活化，再与酶活性部位不可逆结合
根据反应基团来源不同
内生亲和标记试剂
试剂本身的某部分通过化学方法转化为所需要的基团，而对试剂的结构没有大的扰动
外生亲和标记试剂
从外部直接引入反应性基团
不需要通过额外的活化反应
可直接再结合部位标记酶侧链基团
光亲和标记试剂（特殊的）
具有一般亲和标记试剂的特点及光反应基团
暗条件下，试剂与酶活性部位特异性结合
光照激发，产生高活性碳烯或氮烯自由基
与附近几乎所欲基团反应，形成共价标记物
主链修饰
肽链有限水解修饰
指再肽链的限定位点进行水解，使酶的空间结构发生精细变化，从而改变酶催化特性的方法
酶原激活实例
胃蛋白酶原的自激活
保护作用，避免过量的胃蛋白酶对胃壁自身进行消化
胰蛋白酶原的水解激活
胰凝乳蛋白酶原的激活
大肠杆菌聚合酶Klenow片段的生成
核苷酸链剪切修饰
仅见于R酶的分子修饰，指在R酶的核苷酸链限定位点进行剪切，生成新的RNA 片段，改变R酶的结构和催化特性
实例
L-19IVS的成熟
氨基酸及核苷酸置换修饰
氨基酸置换修饰
将酶分子上某一个氨基酸置换成另一个氨基酸，从而改变酶催化特性的修饰方法
作用
提高酶的催化效率
增强酶的稳定性
改变酶的专一性
方法
化学转化法
对某些侧链结构相似的aa残基进行基团修饰，从而改变册灰姑娘另一种残基
难度较大，很难精确操作
定点突变法
在DNA 序列中某一特定位点上进行碱基的改变（转录水平改造）
主要步骤
肽链一级结构和DNA 序列设计
突变基因的核苷酸序列确定（逆推法）
突变基因的获得
新酶的获得——重组表达
核苷酸置换修饰
将R酶分子核苷酸链上的某个或数个核苷酸置换成其他的核苷酸，一般采用定点突变技术实现
意义
在了解R酶催化中心必需基团的情况下，据此进行分子改造，可设计出反应活性不同的R酶
实例
L-19 IVS 活性中心核苷酸置换对催化特性的影响
锤头型核酶
发夹型核酶的置换修饰
物理修饰
通过物理方法，使酶分子的空间构象发生某些改变，从而该百年酶的某些特性和功能的方法
特征
非共价的修饰方法
不改变酶的组成单位及基团
酶分子中的共价键不发生改变
一级结构不变
次级键发生某些改变和重排
高级结构发生变化
方法
高压、热激、高渗、变形条件等
意义
可用于研究极端条件下酶结构和活性的变化
效果
改变底物特异性
改变酶的最适温度
提高酶的稳定性
酶的定向进化
模拟自燃进化的过程，在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体
过程
随机突变
产生基因多变性
易错PCR
通过改变PCR反应条件来调整PCR反应中的突变频率，得到随机突变的DNA 群体
方法
使用低保真度DNA 聚合酶
调整4种dNTPs的浓度和比例
提高镁离子浓度
引入锰离子
缺点
经一次突变的基因很难获得满意的结果
基因的遗传变化只发生在单子分子内部，一般只适用较小的基因片段
只能实现点突变，突变剪辑并没有大面积发生变化
改进
连续易错PCR
将一次扩增得到的有益突变基因作为下一次扩增的模板
连续反复进行多轮随机诱变，累积正向有益突变
DNA 改组
DNA 片段的体外重组，使基因分子水平上进行的随机重组
特点
基因组大片段的随即替换
使基因重新组装的过程，包含了不同突变体发生的突变
方法
结果
将亲本基因群中的优势突变尽可能组合在一起，最终使酶分子的某一行止得到进一步进化
构建突变基因文库
将突变基因与适当的载体重组
特点
包容性
完整性
文库构建过程
选择载体
基因重组
转化宿主
定向选择
高通量筛选方法
作用
提高酶的热稳定性
提高酶的活性
修饰酶的性质变化
热稳定性
最适pH值
半衰期
体内抗原性
酶动力学性质
组织分布特性
子主题 7
应用
酶学研究方面
酶活性中心研究
判读那某种基团是否位于酶活性中心
酶空间结构研究
荧光修饰侧链基团，通过荧光光谱了解酶的空间构象
利用巯基修饰剂确定酶分子中的Cys残基数目和分布
酶作用机制研究
了解各残基或基团在催化过程中的应用
亲和标记法
差示标记法
氨基酸置换法
核苷酸置换法
医学领域应用
降低或消除酶的抗原性
增强医用酶的而稳定性
工业生产应用
提高工业用酶的催化效率
增强工业用酶的稳定性
改变酶的动力学特征
其他方面应用
有机介质中酶催化能力提升
抗体酶研究开发
核酸类酶的人工改造
相关思维导图模板
树图思维导图提供 急性胰腺炎的辅助检查 在线思维导图免费制作，点击“编辑”按钮，可对 急性胰腺炎的辅助检查 进行在线思维导图编辑，本思维导图属于思维导图模板主题，文件编号是：600cb8253882a4767a368eba75408230
树图思维导图提供 第四章市场营销调研 在线思维导图免费制作，点击“编辑”按钮，可对 第四章市场营销调研 进行在线思维导图编辑，本思维导图属于思维导图模板主题，文件编号是：0a166ea6cec252ef7f0c6d9e0f498e3a
沪公网安备 31011502019485号
上海工商