三维条件下高糖对牙周膜干细胞成骨成脂分化潜能的影响思维导图

三维高糖

牙周膜干细胞

对于细胞成骨成脂分化潜能的影响

探索在三维培养条件下，高糖环境对牙周膜干细胞（PDLSCs）的成骨和成脂分化潜能的影响

利用明胶材料和谷氨酰胺转移酶构建三维培养条件，通过鬼笔环肽染色观察细胞形态特点; 细胞在不同葡萄糖浓度( 5． 5 mmol /L 和 25mmol /L) 的培养基中孵育后，通过碱性磷酸酶( ALP) 染色、茜素红染色和实时定量 PCＲ 检测细胞成骨分化潜能，油红 O 染色和实时定量 PCＲ 检测细胞成脂分化潜能

高糖环境下，PDLSCs 的 ALP 活性降低、矿化结节形成减少，成骨分化相关基因 ＲUNX2、BMP2 和 OCN 表达降低; 脂滴形成增加，成脂分化相关基因 Adiponectin 表达升高

三维培养条件下高糖可抑制 PDLSCs 的成骨分化，促进其成脂分化

高糖环境对细胞的影响

高糖与牙周膜干细胞的关系

牙周膜干细胞

胎牛血清、高糖 DMEM 培养基、低糖 DMEM 培养基( Gibco 公司，美国) ; ALP 染料、ALP 活性检测试剂盒( 上海碧云天生物技术有限公司) ; 茜素红染料、油红 O 染料、阿利辛蓝染料( Sigma 公司，美国) ; 明胶、谷氨酰胺转移酶( 北京唯辉生物有限公司) 。Ｒeal TimePCＲ 仪( Bio-Ｒad 公司，美国) ; 激光共聚焦显微镜、倒置相差显微镜( Olympus 公司，日本)

人 PDLSCs 的分离培养

三维培养条件的构建

鬼笔环肽染色

成骨和成脂诱导

ALP 染色和活性检测

茜素红染色和矿化结节定量

油红 O 染色和脂滴定量

实时定量 PCＲ( qＲT-PCＲ) 检测

所有的实验数据都至少包括 3 个生物学重复，每个生物学重复包括 3 次技术重复。数据采用 GraphpadPrism 8 软件进行统计，用 x±s 表示。采用独立样本 t检验对两组间差异进行比较，P＜0．05 则认为有统计学差异。

PDLSCs 高表达间充质干细胞表面标记物( CD105、CD146) ，低表达CD31、CD34、CD45

甲苯胺蓝染色可见蓝紫色的细胞集落

CCK-8 检测结果显示这些细胞具有体外增殖能力

倒置显微镜可见，三维培养条件下 PDLSCs 呈圆形分层排列

鬼笔环肽染色结果显示，三维培养条件下细胞呈圆球形，细胞膜紧密地围绕在细胞核的周围

ALP 阳性细胞减少、细胞的 ALP 活性降低

形成的矿化结节数量减少

qＲT-PCＲ 结果显示，HG组 PDLSCs 中成骨相关基因 ＲUNX2( P＜0．05) 、BMP2( P＜0．05) 和 OCN( P＜0．01) 表达显著降低，Col-1表达有所降低，但未见统计学差异

形成的脂滴增加

成脂相关基因Adiponectin 表达显著升高( P＜0．01) ，PPAＲG 表达有所升高

目前研究者们通常使用二维培养条件来进行体外细胞研究，这种平面培养条件与细胞生活的体内微环境存在明显差别，可能造成细胞生长状态的差异。本实验借助明胶材料和谷氨酰胺转移酶来构建体外三维细胞培养条件，以更好地模拟体内细胞生活的微环境; 本研究发现三维培养条件下 PDLSCs 呈分层排列、没有向周围形成的突起，且细胞膜紧密地围绕在细胞核周围

本实验通过构建体外三维培养条件，发现高糖环境可抑制 PDLSCs 的成骨分化并促进其成脂分化，这些结果有望进一步揭示高糖环境对干细胞性能的损害

证实在体外三维培养条件下高糖环境可抑制 PDLSCs的成骨分化，而促进其成脂分化，提示 PDLSCs 应用于糖尿病人群牙周组织再生可能面临的风险