幽门螺杆菌工程疫苗研究进展思维导图

在菌株中含量丰富，分布在细菌表面，广泛表达和高度保守；其大分子量和颗粒状结构也更有利于粘膜免疫接种。Pappoetal用纯化的HelicobacterfelisUreB亚单位和CT口服免疫小鼠后可抗Hf定植，而UreA亚单位则无保护作用，UreB亚互单位和LT口服免疫小鼠，同样产生抗Hf感染保护力，重组的Ure和LT口服、鼻腔、直肠免疫同样能够诱导小鼠产生免疫保护力，Ure抗体被动免疫小鼠后也能预防Hf感染的事实，间接说明Ure诱导产生的免疫保护力是体液免疫应答介导的，螺杆菌属的Ure同源性非常高，HpUreB亚单位和佐剂CT口服免疫小鼠可抗Hf感染的事实，说明螺杆菌属的Ure存在交叉性表位，免疫后可引起交叉性保护，目前在小鼠模型上已证实多种Hp抗原包括VacA，Ure，CagA，过氧化氢酶、HpGroES类蛋白等。都可诱导小鼠产生免疫保护力。

疫苗能否清除已有的感染？Doidge采用Hp超声裂解物和重组UreB亚单位，结合CT口服免疫慢性Hp感染小鼠，结果证实口服免疫兼具预防和治疗双重作用，Doidge在Hm感染的雪貂中也发现类似结果。Ghiaraetal研究了Hp相关抗原作为疫苗治疗慢性Hp感染效果，同时也试验大肠杆菌突变脱毒肠毒素作为粘膜佐剂的可能性，结果表明不管是Hp超声裂解物或者重组蛋白VacA和CagA，与UTK63一起免疫，都成功地清除了小鼠体内已有的Hp，并且免疫3mo后仍无感染，Marchettietal实验了LT，LTK63佐剂与全菌、内源性VacA，Ure，CagA及重组VacA，CagA的免疫保护作用，发现都可激发小鼠产生免疫保护。

2.关于佐剂粘膜免疫  需要强的佐剂以提高抗原的免疫原性，粘膜佐剂可刺激Th2型粘膜免疫反应。未来的Hp疫苗必须辅以能有效诱导粘膜免疫的佐剂，活化Th2细胞免疫途径，才能产生大量的slgA，才能克服Hp抗原性弱的问题。CT和LT是目前研究最为深入的粘膜免疫佐剂，它们都具有较强的粘膜免疫原性和粘膜佐剂效应， 与不相关可溶性蛋白抗原同时口服免疫机体，能消除机体对这些免疫蛋白的耐受性，诱导机体产生针对CT及其免疫蛋白的长期免疫记忆。

3.关于疫苗蛋白质分子的空间结构及抗原表位预测  抗体分子在抗原上的结合位点称为抗原决定簇，又称抗原表位。它是蛋白质的表面性质，常出现在分子的高暴露区域，其性质、数目及空间的构型决定其抗原特性，为精确描述抗原决定簇，可用同源蛋白质来评价特定氨基酸替换的影响以确定抗原表位的所在区，不过这里的表位是指“功能表位”，即一种蛋白质能在免疫检测中结合抗体的那一部分或片段、因此研究某种蛋白质有意义的亚单位结构和功能，它在实验使用上有买际意义。利用计算机软件可以预测蛋白质的空间结构和抗原位点，这可作为抗原多肽合成试验的选段参考，适当左右扩展成10～20肽，也可用作抗原克隆表达实验前PCR引物设计时模板范围选择的参考，使扩增出的序列能够覆盖较多的预测点，这对我们研制Hp基因工程疫苗有重要指导意义。

4.Hp疫菌的免疫保护机制  免疫应答类型的确定直接决定人类疫苗学研究发展，Hp感染的免疫应答类型很难确定，这是因为自然感染Hp后，引起的免疫反应无保护性；而感染Hp的啮齿类动物，采用经典免疫学技术很难分析疫苗的治疗性免疫应答机制。最近有报道在Hp感染者胃粘膜中slgA水平明显高于对照组，提示粘膜slgA在抗Hp感染中具有重要作用，Doigeetal用Hf超声裂解物免疫小鼠，发现抗螺杆菌slgA水平与保护作用密切相关。T淋巴细胞在Hp感染中的保护作用目前知之甚少。Hp感染患者外周血单核细胞的刺激和抑制作用已有报道，Hp感染的小鼠和人类，THI细胞被抑制，小鼠的保护性免疫与THI细胞抑制和TH2细胞活化密切相关。目前Hp疫苗诱导机体产生保护性免疫和治疗作用的机制仍不清楚，Ghiaraetal认为疫苗可能改变胃内Thl型应答反应，转变为THO或Th2型保护性反应；并且在慢性Hp感染小鼠模型中出TH1细胞反应口服Hp菌苗诱导THO或Th2细胞活化反应，清除体内感染的细菌，Hp感染的小鼠模型研究发现Th2反应刺激程度与胃粘膜内细菌减少和胃炎消退密切相关，Hp免疫小鼠体内发现IFN-γ下清Thl反应，胃内Th2细胞分泌IL-4水平增高；体外培养Hp免疫小鼠后，发现大量脾细胞中有Hp特异Th2细胞，脾细胞接种其他动物发现明显减少胃内Hp感染量。Mohammadietal也发现相似结果，并证明IL-4基因敲除小鼠体内Hp感染数量明显高于对照组，目前研究表明Hp慢性感染人群Thl细胞反应占主要地位，人类胃粘膜反应是否与小鼠相同？如果类似，采用无毒粘膜佐剂，治疗性疫苗可能是清除Hp感染的新的方法。

5.Hp感染的动物模型  研制Hp疫苗的先决条件是必须建立合适、稳定的Hp慢性感染动物模型，以分析免疫应答和免疫保护机制。在螺杆菌属细菌中，Hf与Hp的生化特征和生物学行为最为接近，其16sDNA基因序列与Hp的同源性高达94.6%，Ure、过氧化物酶、过氧化氢酶均为阳性，生长条件相近，还具有相对较广的宿主范围，Hf在小鼠胃内的定植无明显部位特异性，与人Hp胃内定植部位基本一致，并能引起与人类Hp相关胃炎相似的病理改变。王继德博士etal研究证实无特殊病原菌级Balb/c小鼠对Hf易感，25只小鼠的感染成功率为100%，并能在胃内长期存活达16wk以上，用ELISA法在感染16wk以后的小鼠血清、胃肠液中可检出抗Hf-lgG抗体，并发现该抗体与Hp抗原有明显的交叉反应，这证明两种细菌有许多共同免疫原，Hp定植成功的有悉生猪、狗和无胸腺小鼠。但这些动物昂贵，需特殊饲养条件，且允许观察时间不足1mo，国内学者陈晶晶1990年最道了Hp的wistar大鼠模型的成功复制，但不足之处在于Hp定植时间不超过1mo.有报道用灵长类动物复制Hp模型，由于灵长类动物胃内生理结构与人类高度相似，可望获得长期感染，但该纯系动物不易获得，饲养困难，价格昂贵。另外由于Hp的动物宿主谱较窄，其动物感染模型尤其是常规小动物长期感染模型的建立，向未兄有成功的报道。故人们在研究中广泛应Hp的近缘菌感染小动物模型，Hf小鼠模型是最常用的一种。

6.Hp减毒沙门疫苗  沙门菌是寄生于人和动物肠道的革兰阴性菌，它可以作为其他病毒、细菌、寄生虫等病原体的蛋白、抗原或表位的表达载体，向机体输送单价或多价抗原，诱发系统免疫和粘膜免疫，沙门菌通过其自然感染方式经过粘膜侵入呼吸道、消化道、雌性生殖道等粘膜淋巴组织，M细胞取和运输抗原。触发粘膜免疫反应，剌激slgA特异的B细胞向其他粘膜组织迁移并分化成浆细胞，分泌slgA释放到粘膜表面，防止病原体再度感染。此外沙门菌也可随血流分布到机体的肝、脾和淋巴结等处，寄居在单核巨噬细胞中，激发机体的免疫应答，减毒沙门活菌疫苗表达的外源蛋白，无论采用口服免疫、鼻腔免疫、直肠免疫或阴道免疫，都能诱导哺乳动物产生显着而特异的免疫应答，包括全身和粘膜的体液免疫应答。目前沙门菌载体菌苗系统常见的突变株包括：Ty21a，aro，asd，cya，crp等突变株，其中aro基因突变株不仅高度减毒，而且具有良好的免疫原性，被广泛用作表达多种异源抗原的载体，而cya，crp突变株不仅减毒具有免疫原性，而且是双基因突变，回复突变的可能性极小，因此用该突变株作为载体菌苗很安全。目前减毒沙门菌疫苗研究多利用其天然宿主-小鼠来研究外源蛋白的免疫源性，人类应用减毒沙门菌疫苗也取得了令人鼓舞的成果，目前Hp减毒沙门菌苗载体多为沙门菌突变株，如aro、phoPc等。Gomez-Durateetal用表达HpUreA，B亚单位的减毒沙门菌SL3261aro突变株，口服免疫Balb／c，C57/B6小鼠，然后用野生株攻击，免疫组获100%保护，对照组则无保护作用，血清、胃粘液中抗Ure抗体均升高，说明减毒沙门菌能表达强免疫源性UrE.Corthesyetal用表达Ure的phoPc突变株鼻腔免疫小鼠也获得了满意的保护率，能诱导体液吏疫和细胞免疫，并刺激T细胞增殖、分泌IFNγ，IL-2.IL-4，IL-5，IL-6等细胞因子，说明沙门菌表达的Ure特异诱导了Thl，Th2等淋巴细胞反应。但是Hp减毒活疫苗的研究尚有许多困难待克服：①宿主对Hp减毒沙门菌苗的免疫应答机制及Hp菌逃避甚至破坏机体的免疫应答机制尚不清楚；②需进一步提高减毒沙门活菌疫苗的安全性和免疫原性；③研制稳定、高效表达Hp精制亚单位抗原的减毒沙门活菌疫苗。Hp感染与溃疡和胃癌的相关性己广为接受，耐药苗株不断增多以及发展中国家Hp感染率不断增高的事实，使我们只有寄希望于疫苗来根治和预防Hp感染。国外Hp疫苗的研究已临床前期试验医学教育`网搜集整理。