月季耐逆分子育种研究思维导图
月季耐逆分子育种研究
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思维导图大纲
月季耐逆分子育种研究思维导图模板大纲
4 基因重组技术
基于长引物PCR的分子重组
三条引物和两轮 PCR；本质就是用一条含目的突变的寡聚核昔酸引物进行基因内的剪接
长引物PCR的应用
基因内的片段剪除
RNAi发夹结构的构建
同向串联基因序列的构建
1 导言
月季分子育种现状
花色、花型、花香、开花期、抗逆性
月季耐逆分子育种研究的意义
植被修复、生活品质、城市建设的需要
2 植物耐逆育种的分子机理
植物耐逆相关目的基因
干旱响应基因
细胞膜系统完整性保护相关基因
GSH基因、SOD基因等
增强细胞保水和吸水的能力的细胞渗调物质编码基因
小分子渗透调节物、多胺、 LEA蛋白、K通道蛋白、脱水素等
根系向水性响应基因
主要有木葡聚糖转葡糖酶编码基因
寒冷响应基因
调控基因
如CBF（C-repeat binding transcription factor）
保护基因
COR( cold-regulated gene）
植物耐逆的转录因子调控
转录因子的结构特征
DNA结合域
与DNA特定序列结合，控制目标基因的转录。
转录调控域
调节转录因子的活性和效力，与其他蛋白质相互作用影响基因表达。
寡聚化位点
促使转录因子形成多聚体，增强其功能和稳定性。
核定位信号
将转录因子定位到细胞核，参与基因调控过程。
与植物胁迫相关的转录因子
bZIP、Zinc finger 、MYB/MYC、NAC 、AP2/EREBP转录因子家族
植物DREB转录因子的研究进展
植物的干旱、高盐及低温胁迫应答途径涉及到依赖ABA 和不依赖ABA的信号传导途径
其中 DREB1 转录因子的主要成员 DREB1A/B/C和DREB2转录因子分别参与到不依赖于ABA的低温和脱水(干早或高盐)胁迫应答途径中
DREB1D/CBF4 参与到依赖ABA的脱水应答途径中。这些结果表明，植物在逆境胁迫应答反应中存在着复杂的信号传递途径，并且各种胁迫信号传递途径间通过某些共同的组分联系在一起，构成一个复杂的信号传递网络。
植物XET基因的研究进展
木葡聚糖转葡糖昔酶XET(Xyloglucan Endotransglycosylase)是细胞壁代谢的关键酶，有水解和形成糖昔键的双重功能。XET作用于次生壁形成初期以及次生壁和初生壁连接全过程，通过水解木萄聚糖促使细胞膨大和伸长，随后将水解的糖基连接成新的聚合体，使细胞壁结构很快变得坚固。因此，XET在细胞壁的重构中扮演重要角色。与植物细胞壁的重构、伸长和伸长停止机理密切相关，对植物生长调控具有重大意义
5 月季基因转化受体系统的优化
月季离体培养与植株再生
2,4-D、TDZ对月季伤形成和体发生的影响
3.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/LTDZ最先产生球形的原胚
胚性愈伤的保持与体胚发生
2,4-D和TDZ的EP培养基上长出的歧形胚多数会在后续培养中又膨大成愈伤
光照对月季再生的影响
红光最适宜中国月季子叶胚的形成
ABA对月季再生的影响
含ABA的培养上的愈伤保持持续胚胎发生的能力
月季不同类型体胚的植株再生
有2片子叶的体胚再生频率最高
月季体胚再生的进程
芽状胚和子叶胚都产生于球形胚，子叶胚再生时先膨大子叶，再分化出芽和根
月季转基因体系的优化
外植体
整叶(叶长0.5~0.8cm,带长约1mm 叶柄)带叶柄的整叶
培养基的pH
pH=4.5
抗生素
200mg/L Cef和25 mg/L G418
转化效率
5%
3 植物耐逆分子育种基本技术
分子育种的基本内涵
目的基因的分离与鉴定
根据基因的功能分离目的基因
根据mRNA特异性分离目的基因
根据 DNA的插入作用分离目的基因
植物表达载体构建
受体细胞培养
转基因技术
外源基因整合表达检测
转录水平上对特异mRNA的检测，如Northern 杂交、RT-PCR 等
翻译水平上对特异蛋白质的检测
生化反应检测法:主要通过酶反应来检测
免疫学检测法，如免疫沉淀法、酶联免疫吸附法(ELISA)及 Western 杂交
生物学活性的检测
耐逆相关基因克隆技术
耐逆相关基因的电子克隆
2005 年蒺藜苜蓿基因组数据公布，根据其EST中有DREB，XET基因等与耐早耐寒相关的信息，从蒺藜苜蓿中克隆这类耐逆相关基因并进行功能鉴定，获得有自主知识产权的基因，而且将这些基因用于月季等观赏植物的耐逆分子育种研究。
耐逆相关基因的实验室克隆及序列分析2
先根据基因的特性寒冷或干旱胁迫处理材料，诱导 RNA表达；再提取RNA，从 mRNA 克隆
目的基因的序列分析及功能预测
多序列比对、分子结构预测、进化树分析
目的基因功能鉴定技术
酵母单杂方法、过量表达、沉默
6 月季耐逆分子改良研究
单基因转化
月季DREBIC基因转化
双基因聚合转化
月季DREBIC/XET双基因聚合转化
多基因转化
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