毒力相关基因(VAGs)、抗菌药物耐药性(AMR)和致病性系统发育簇的综合研究和非致病性禽大肠杆菌思维导图

禽致病性大肠杆菌(APEC)是引起禽大肠杆菌病的重要病原菌，给养鸡业造成了巨大的经济损失。不同的毒力特征参与了APEC 感染的发病过程，抗微生物药物耐药性(AMR)也是目前国内外禽类面临的主要问题。在本研究中，我们的目的是调查和比较毒力相关基因(VAGs)的存在，AMR和系统发育群的分布在亚太经合组织(APEC)和禽粪肠大肠杆菌(AFEC)中。用上述性状比较了鸡大肠杆菌与健康鸡粪大肠杆菌(AFEC)的差异。此外，使用肠杆菌重复基因间一致性PCR(ERIC-PCR)比较克隆相关性。尽管所有菌株均对磷霉素、头孢曲松和头孢克敏感，但几乎所有菌株(98%)均为多药耐药(MDR)。所有菌株(除2株外)均至少携带3种或3种以上的VAGs，且致病性菌株的毒力评分趋向于更高，尤其是在大肠菌群中。在YSI、结肠败血病和健康禽粪的分离物中发现了所有的系统发育群，但是系统群的频率因分离物的来源而异。B1和C系统群分别在YSI和大肠埃希菌群中更有可能出现，而A系统群是AFEC菌株中最常见的系统群。我们的发现还表明，AMR和VAG本质上不是共同进化的性状，因为在某些情况下，AMR菌株在AFEC中更普遍。这反映了致病性和非致病性禽E.coli菌株获得抗性的不同进化途径。重要的是，与系统发生群C相关的菌株表现出较高的毒力评分和AMR，这需要进一步关注。到在一定程度上，ERIC-PCR能够根据分离源、系统组或毒力基因对菌株进行分组。进一步的综合研究以及对更详细的基因型和表型特征的评估可能会导致对expec的毒力、抗性和进化的更好理解。

关键词

介绍

禽致病性大肠杆菌(APEC)是引起禽大肠杆菌病的病原体，是家禽的重要细菌性疾病之一，在世界范围内造成了巨大的经济损失(1)。肿胀头综合征、卵黄囊感染(YSI)、蜂窝织炎以及不同器官的炎症，如心包炎、气囊炎和肝周炎(2)。死亡率和尸体定罪(3)。毒力特征在亚太经合组织感染的发病机制和流行病学中非常重要(4)。通常，从大肠杆菌病病灶分离的大肠杆菌菌株和含有毒力相关基因(VAGs)的菌株，如编码粘附素、毒素、侵袭素、铁清除系统和血清存活的菌株，被分类为APEC(5，6)。需要几种VAG的组合来赋予APEC致病性，通常没有单一VAG单独导致鸡的疾病(5)。根据文献，某些血清型似乎与APEC中的毒力相关，如大多数O78和O2，其次是O18和O1导致了全球超过一半的大肠杆菌病病例(5)。从一个健康的角度来看，亚太经合组织似乎也在人类疾病方面发挥了作用。大肠埃希菌是肠外致病性大肠杆菌(expec)的一个亚群，不同于共栖性大肠埃希菌和致泻性大肠埃希菌。不同的研究表明，APEC和expec菌株在血清型、系统发育群、毒力因子、以及在各种人类和动物疾病模型中引起疾病的能力(7-9)，以及在供人类消费的零售家禽肉类中出现具有expec特征的大肠杆菌(10)。因此，APEC菌株可能通过在人类宿主中引起疾病或通过质粒连接的VAG水平基因转移至人类共生菌株而构成人畜共患病威胁(11，12)。重要的是，许多已知对APEC毒力有贡献的VAGs与在大的可传播质粒上发现的致病性岛(pals)有关(13，14)。此类质粒可使共生菌株在人类和动物疾病模型中引起疾病(15，16)。

APEC菌株的重要性的另一个原因是它们中抗生素耐药性(AMR)的增加。在动物和人类细菌中不断增加的AMR已导致全球范围内的担忧(17)。多药耐药(MDR)细菌在家禽中经常报告(17，18)。抗生素作为生长促进剂，用于治疗、控制和预防细菌感染性疾病。家禽业(19)。总之，这些因素导致家禽业的AMR指数较高(3)。这些抗性菌株可能是人类通过鸡肉产品或直接接触受感染禽类产生AMR的来源(20)。

关于VAGs与AMR之间的关系，存在着不同的观点。一些研究人员认为大肠杆菌菌株的VAG与AMR更相关(21，22)，而其他研究人员则认为VAG甚至可能与AMR弱或负相关(23，24)。

在本研究中，我们旨在通过比较亚太经合组织和来自明显健康鸟类的禽粪大肠埃希菌(AFEC)的特征来获得更广阔的视野来研究VAGs和AMR的存在。

材料和方法大肠杆菌的样品收集和分离在本研究中，对从伊朗塞姆南省23个肉鸡场回收的100株大肠杆菌进行了调查。分别从该地区的8个、10个和5个农场获得YSI、败血症和健康鸡样本。由于没有无大肠杆菌病的农场，健康的鸡样本从TARMS获得，由于细菌或混合感染，死亡率最低。

总之，从表面健康的鸡(AFEC)的盲肠液中采集标本，从肉仔鸡尸体的肝脏和心脏血液中采集具有典型临床和病理特征的大肠杆菌血症和YSI败血症的鸡(伴有肝周炎或心包炎)。分别在尸检时从卵黄囊中对感染YSI的鸡进行采样。将样品在麦康凯琼脂(Merck，Germany)上划线并在37°C下孵育24小时。为了鉴定大肠杆菌分离物，对疑似乳糖发酵菌落进行常规生化试验，包括糖发酵(使用TSI培养基)、柠檬酸、甲基红、Voges-Proskauer(MR-VP)和脲酶产生，赖氨酸脱羧酶和吲哚(25)，最后，从每只禽中选择一个经确认的大肠杆菌分离株，并考虑作为该病例的代表菌株进行进一步分析。

抗菌药物敏感性模式

根据临床实验室标准研究所，采用纸片扩散法测定了分离株对15种不同科抗微生物药物的耐药性模式(26，27)。对于氟苯尼考，考虑氯霉素的断点，因为CLSI指南中没有可用的断点。抗菌剂的选择依据在伊朗动物中广泛使用的药物。此外，还包括一些农民非法使用的人用药物中的一些抗菌剂。本研究中使用的抗菌剂包括恩诺沙星(5μg)、氟甲喹(30μg)、头孢克肟(5μg)、新霉素(30μg)、链霉素(10μg)、庆大霉素(10μg)、林可舒定(200/15μg)、氯霉素(30μg)。氟苯尼考(30μg)、呋喃唑酮(100μg)、四环素(30μg)、磺胺甲恶唑+甲氧苄啶(125/23.7μg)、头孢曲松(30μg)、Fosbacw(磷霉素；200μg)和头孢唑林(30μg)。所有抗菌片均购自Padtan Teb(伊朗)。

分子O-血清分组

通过先前开发的多重PCR分析(28)，研究了所有大肠杆菌分离株在APEC菌株(包括O1、O2、O18和O78)中普遍存在的O抗原。

系统发育分析与毒力相关基因

采用煮沸法提取分离菌株的细菌DNA

(29).根据Clermont等人开发的基于PCR的改良方法进行系统发育分类。(30).根据yjaA和Chua基因以及TspE4.C2DNA片段的存在与否，旧的系统发育分组将分离物分为四组(A、B1、B2和D)。在修订的系统发育分析中，还使用ARPA基因将分离株分配到八个组中的一个：A、B1、B2、C、D、E、F或分支I(30)。

使用前述引物和PCR条件研究大肠杆菌菌株是否存在与APEC病型相关的最显著VAG(31-36)。所选基因与铁获取(Iuta和铁)、毒素/大肠杆菌素(hlyA、COLV和Asta)、血清抵抗(iss和Trat)、细菌粘附素(tsh、csg、PAPC和PAPG)和侵袭因子(IBEA和OMPT)有关。以各菌株检测到的毒力基因总数作为分离毒力评分(VS)，阳性对照由Mashhad Ferdowsi大学(FUM)和德黑兰大学微生物档案提供。

肠杆菌重复基因间一致性PCR(ERIC-PCR)使用前述ERIC-PCR对分离株进行指纹识别(37)。为了分析数据，基于分数分别为1或0的条带的存在或不存在，假定凝胶电泳中的条带模式为二元矩阵。使用NTSYS-pc2.02e版本的SIMQUAL程序构建dendrogram。利用Jaccard相似系数和算术平均的非加权对组法(UPGMA)计算分离物之间的相似性水平。

统计分析

采用卡方检验和Fisher精确检验，用SPSS26.0软件进行组间比较。p<0.05的结果被认为是有意义的。使用统计程序GraphPad Prism，版本8，软件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)。使用Spearman相关系数矩阵测量VG与抗生素表型耐药性之间的相关性。使用GraphPad Prism8绘制的热图可视化的结果。只有p<0.05的相关性才被认为是显著的。为了找出各组中最显著的差异，在表格中适当地用(*)表示超过2的最高调整后残差值，以突出显示导致最高调整后差异的单元格。

为了根据VAGs和AMR模式对菌株进行分类，使用SIMQUAL构建了树系图。VAGs的存在与否和对抗菌药物的耐药性分别被认为是1分或0分。并根据菌株的VAGprohle绘制了树系图。为了显示根据分离源和系统发育组的菌株分布，使用在线Circos绘图软件绘制了一个圆圈。结果从不同条件下的肉鸡中分离到100株大肠杆菌。与大肠杆菌血症、Yisis和健康鸡相关的菌株数量分别为32、32和36。

抗菌药物敏感性

测定了大肠埃希菌对15种抗菌药物的敏感模式(补充表1)。所有菌株对磷霉素、头孢曲松和头孢克肟敏感，而50%或以上的菌株对头孢克肟敏感。

除庆大霉素和呋喃唑酮耐药率分别为26%和38%外，大肠埃希菌株对其他药物均有耐药性。从病禽和健康鸡粪便中分离的大肠杆菌中，80%以上的菌株对链霉素、四环素、氟美喹和林可观素有耐药性。总体而言，98株(98%)菌株被认为是MDR(对3种或3种以上试验药物耐药)。粪便菌株对庆大霉素和恩诺沙星的耐药性显著高于APEC菌株，如补充表1所示(p<0.05)。

毒力相关基因

表1显示了大肠杆菌菌株中VAG的患病率。所有菌株(2株除外)至少含有3株或3株以上的VAG。最常见的检测基因是tonb。CSG和Iuta的患病率分别为99、96和83%。在APEC中，iss Iuta、tsh、hly、铁和OMPT基因在大肠埃希菌病损株中出现的可能性显著增加，而与YSI和CS菌株相比，Asta基因在AFEC菌株中更普遍(p<0.05)。

，5个VAG中至少4个的APEC被认为是高毒力APEC；因此，91个(91%)菌株可被认为是潜在的APEC。与YSI和AFEC相比，大肠菌群中这些特征标志物的频率具有统计学显著性(表2)。

大肠杆菌病参与了感染和疾病的发生，了解这些关系对于阐明大肠杆菌病的发病机制非常重要。相关分析显示iss、hly、Iuta、铁和OMPTVAGs之间存在相关性。该基因图谱似乎在APEC致病性中起着重要作用，正如Johnson等人先前的研究中所确认的那样。(14).我们还发现tsh与其他APEC预测基因之间存在正相关；然而，tsh与Iuta之间的相关性强于其他基因。Iuta编码参与铁获取的铁需氧杆菌素受体。将一组Juta/tsh均为阳性而其他预测基因均为阴性的菌株置于AFEC组。因此，这两个基因的关联似乎不足以预测APEC的致病性。PAPG和PAPC基因之间存在非常强的关联，PAPG和PAPC基因是染色体上pal内pap操纵子的一部分(56)。

关于AMR和VAGs之间的关系，人们提出了两种可能性：第一，抗性菌株毒力更强，因为许多遗传因素，如质粒、整合子，复合转座子可能同时携带VAGs和AMR基因。另一方面，一些研究人员认为AMR菌株的毒力比敏感菌株低，因为AMR和毒力不一定同时进化(23，57)。在本研究中，未发现VAGs与抗性表型之间的关系。OMPT与四环素、tsh和呋喃唑酮耐药仅呈弱阳性相关。特定宿主、地理来源和使用的抗菌剂类型可能会影响AMR和VAG之间的关系(58)。

氯霉素与氟苯尼考之间存在较强的交叉耐药现象。氟苯尼考是氯霉素的类似物，尚未批准用于人体。据报道，对氯霉素和氟苯尼考的交叉抗性是由大肠杆菌flo基因的非酶活性引起的。恩诺沙星(喹诺酮)和氟甲喹(氟喹诺酮)之间存在较强的交叉耐药性。喹诺酮类和氟喹诺酮类药物的耐药性是通过某些染色体基因(如gyrA和Parc)的突变获得的，或通过获得大量质粒编码的基因获得的(59)。

根据系统发育群的分类结果表明，AFEC菌株主要属于A群和E群，而大肠埃希菌和YSI菌株分别属于C群和B1群。在AFEC的其他系统群中，系统群A的VS值最低。相反，虽然A组中只有3株大肠菌株，但其VS平均值(8.3)较高，这表明特定系统组内VS不一致。C组VS均数最高，且该系统群的大部分菌株分离自肠炎性病变，尽管少数报道表明该系统群接近于B1或A群(60，61)，本研究表明，与系统群C相关的菌株具有较强的毒力，在大肠杆菌病的发生发展中起着重要作用。相反，系统群Bl在共生菌株中更常见，毒力较低。从YSL病损中分离的B1群菌株具有最低的VS，并且与两个主要的APEC毒力基因(iss和OMPT)负相关。

PAPC和PAPG基因明显更普遍。PAP基因簇位于细菌染色体上，是B2组UPEC菌株常见的毒力基因。应注意的是，最近比较APEC基因组特征的研究表明，致病性菌株的多系进化使比较变得困难。例如，078属于系统群C和G(ST-23和ST-117)和O1中的两个谱系，而O2属于B2系统群(ST-95，ST-140和ST-428/429)(62)。几项研究发现，APEC和UPEC菌株在系统发育上接近，共享一些相同的VAGs，因此应被视为潜在的人畜共患病(7，62-64)。

通过UPGMA对ERIC-PCR、VAG-AMR和VAGs的数据进行聚类分析，以确定哪种方法更适合菌株的分类。ERIC-PCR共鉴定出15个簇。综合分析表明，在许多情况下，属于一个簇的菌株在毒力抗性、来源和系统发育类群方面具有高度相似性。聚类7包含大多数从结肠炎性病变分离的系统发育组C，也具有高的毒力和AMR评分。簇9主要由AFEC菌株组成属于A组，毒力和抗性评分较高。属于簇2和簇5的菌株具有相似的起源和系统发育群，几乎相似的VAGs。因此，ERIC-PCR可作为流行病学研究中菌株初步分类的一种实用方法。然而，关于ERIC-PCR对克隆分化的鉴别力存在不同的观点。一些研究建议ERIC-PCR用于研究APEC菌株的克隆多样性和表型与基因型之间的关联(65，66)，但其他研究人员不同意(67)。

结论

在本研究中，我们试图对复杂的APEC病理类型有一个鸟瞰的视角。我们的发现表明，禽大肠杆菌的毒力和AMR并不是本质上相关的性状，在某些情况下，共生菌株可能表现出更大的抗性。这表明抗性和毒力的进化是不一致的，因此，对家禽养殖场的AMR监测不能仅仅依赖于病禽的恢复品系。在抗菌管理策略尚未严格实施的情况下，这一点尤为重要。在本研究中。与其他组相比，与系统发育组C相关的菌株具有更高的毒力和AMR评分，这表明该系统组在疾病负担和AMR问题中的重要性。APEC/AFEC和UPEC菌株共有的VAG贮库表明，禽E.coli可能是人类expec菌株的潜在VAG贮库，因此是一种潜在的人畜共患病原体。对更多菌株的进一步综合研究，以及对更详细的基因型特征的评估，可能有助于我们提高对expec的毒力、抗性和进化的认识。

数据可用性声明

提供完成本研究项目所需的设施。作者还想感谢Frontiers的编辑和审稿人提供了明确的交互式反馈，帮助我们改进了原稿。

研究中提供的原始贡献包含在文章/补充材料中，可向相应作者进一步询问。

补充材料

伦理声明

本文的补充材料可在网上找到：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2021.758124/full#supplementary-material

动物研究不需要伦理审查和批准，因为我们没有对动物进行研究，并且可以从先前批准的研究中获得分离株，因此不需要重新提交以获得新的批准。

补充图1|基于大肠杆菌菌株毒力相关基因谱数据的带算术聚类(UPGMA)树状图的Ur加权对组法。基于63%(蓝线)的相似性指数，发现了5个主要聚类(1-V)。这些颜色的含义如下。卵黄囊感染

作者贡献

菌株：：败血症菌株；：粪便菌株：1:F群；1:F群

a：：噬菌群B2:t噬菌群E：：：噬菌群B1；：噬菌群C；ERIC。肠杆菌重复基因间consenus蓝色框表示存在与感染相关的基因。E:O1；**：02；***：078。

SR和MA设计研究并分析数据。Ma、AN和MS进行了研究。SR编写了初稿。SR、MA和SP有助于撰写和批判性地审查手稿，并协助数据分析。所有作者均参与了文章并批准了提交的版本。

补充图2|基于Escherichis coff菌株的抗微生物药物表型和毒力相关基因多态性数据的算术库斯特法(UPGMA)树状图的非加权对群法。

基于70%的小型指数(backlineel)，发现了9个主要聚类(A-)。

颜色表示如下：：卵黄囊感染菌株；1：败血症菌株；粪便菌株；F组；A组；B2组：

致谢

噬菌体组E；系统组B1：：噬菌体组C；ERIC：肠杆菌重复基因间共有。*01；*x；02；***078。

作者对Lisa博士表示感谢

补充表1|从病禽和健康鸡粪便中分离出的禽埃希菌菌株的耐药性。

K.Nolan(美国佐治亚大学)，对手稿草稿进行了亲切的审查，并提出了建设性的建议。作者非常感谢马什哈德费多西大学(FUM)

补充表2|禽埃希菌不同性状间相关性的P值。

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