复发性口腔溃疡和消化性溃疡患者口腔及胃粘膜中的幽门螺杆菌思维导图

①所有受检者取样前1周内未服用任何抗生素、铋剂、抗酸剂及H2受体拮抗剂，1个月内未服用类固醇类药物或非类固醇类抗炎药如阿司匹林等；②所有受检者均无严重全身性系统疾病，非Ⅱ度或Ⅱ度以上牙周炎患者、非口腔粘膜扁平苔藓患者；③各组间年龄、性别、取样位置和方法、患者牙周条件等可控制因素通过均衡检验，证实无差异，具有可比性。

所有受检者检测晨均按指导刷牙，取样前用无菌生理盐水轻轻将口腔漱干净，然后刮取每位受检者颊、舌、口底、软腭粘膜少许（ROU患者以溃疡假膜代替相应部位的口腔粘膜），同时通过胃镜取胃体部粘膜（PU患者取溃疡部位）作为标本，置于无菌生理盐水的尖嘴离心管，-40℃保存备检。将备检标本放入400μl无菌生理盐水溶液中离心12000r/min×5min，弃上清，加DNA裂解液50μl，蛋白酶K2μl，55℃孵育1h，100℃水浴10min，同时设置阳性模板和阴性对照（PacificEcon-TechCo.USAPCR试剂盒）；15000r/min×5min离心后，取5μl进行PCR检测。PCR扩增产物取15μl，用15g/L琼脂糖凝胶（含0.5g/L溴化乙锭）经TAE电泳缓冲液，电泳30min（电压5v/cm）后在紫外透射反射仪300nm下观察结果，如果在200bp处出现橙黄色条带，则诊断为Hp阳性（+）。

胃粘膜Hp培养：

①荧光抗体的制备：胃粘膜培养出来的Hp4株混合配制成每毫升10亿个细菌的悬浮液，耳缘静脉注射免疫家兔，8次后查血，凝集效价为1：2560，特异性实验与大肠杆菌、空肠弯曲菌凝集效价均不超过1：80.抗体血清用不饱和硫酸铵提成粗球。再用0.25mol/L硫酸盐缓冲液将粗球抗体稀释成1%浓度后装入透析液中，用同一缓冲液将异硫氰酸荧光素配成0.1g/L，10倍于1%抗体体积，放入烧杯中，用电磁搅拌器在4℃冰箱内透析24小时，经sephadex-G50层析，去除游离荧光素。②染色方法：将口腔溃疡假膜稀释于0.1ml的生理盐水中，搅匀后涂于盖玻片上，经固定后滴上荧光抗体，置于37℃暗室冰箱中30分钟，再经pH值7.2的硫酸盐缓冲液冲洗3次，封片。荧光显微镜观察，以胃粘膜培养出的Hp作阳性对照。