人B、N、C基因甲基化联合检测
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人B、N、C基因 甲基化联合检测思维导图模板大纲
送检外周血标本:离心3000rpm/10min,吸上清至EP管
高速离心12000rpm/10min吸上清至新的EP管,开始实验
送检血清标本:
已高速离心的血清标本,化冻后离心12000rpm/3min吸上清至EP管,开始实验
未高速离心的血清标本,化冻后离心12000rpm/10min吸上清至EP管,开始实验
准备10mLEP管,150uL胰脂肪酶+1500uL标本,涡旋震荡混匀后,室温静置5min
加入150mL蛋白酶K和2700uLbufferA,上下颠倒混匀后,瞬离至3000rpm即按停
水浴70 ℃孵育15min
加入预冷1500mL异丙醇,上下颠倒混匀10次,瞬离至3000rpm即按停,-20℃冰箱内孵育5min
吸取835uL标本加入吸附柱(绿色)中,离心12000rpm/1min,重复步骤,直至标本全部过柱收集离心完毕
加入预冷600uL漂洗液Ⅰ,离心12000rpm/1min,弃废液
加入预冷600uL漂洗液Ⅱ,离心12000rpm/1min,弃废液
将吸附柱置于新的收集管中,空甩离心12000rpm/3min
将吸附柱置于新的离心管中,开盖晾干3min
向吸附膜中央悬空滴加53uL洗脱液,室温静置3min,离心12000rpm/2min,将收集到的洗脱液再次加入到吸附膜中,进行重复洗脱,收集DNA并测浓度、纯度及做好记录
配置转化液: 转化液干粉+750uL水+210uL缓冲液 涡旋震荡10min
20uL阴性对照品+25uL水,45uL阳性对照品,45uL标本,各加入5uL缓冲液,配置成50uL体系,金属浴37℃孵育15min
加入100uL转化液, 金属浴50℃避光孵育12-16小时
孵育完成后瞬离,4℃冰箱孵育10min,瞬离
向吸附柱(白色)中加入400uL结合液,标本转移到吸附柱中,上下颠倒混匀10次,离心12000rpm/30s,弃废液
加入100uL漂洗液, 离心12000rpm/30s,弃废液
加入200uL脱磺液,室温孵育18min后, 离心12000rpm/30s,弃废液
加入200uL漂洗液, 离心12000rpm/30s,弃废液,重复步骤
将吸附柱置于新的收集管中,空甩离心12000rpm/3min
将吸附柱置于新的离心管中,开盖晾干5min
向吸附膜中央悬空滴加20uL洗脱液,室温静置3min,离心12000rpm/2min,收集Bis-DNA;
配置反应体系:PCR反应预混液10uL/1人份+引物探针混合液4uL/1人份
充分混匀后14uL/管分装至八联管中
往八联管孔中加入6uLBis-DNA,共20uL体系,盖紧管盖,瞬离,避免气泡
打开气压原、微滴生成仪、封膜仪电源开关;取微滴生成芯片装配至配套底座,向芯片孔第一行加入50uL微滴生成油,第二行加入20uL产物,向产物上悬空滴加5.3uL密封剂,盖上配套的硅胶盖
打开气压原启动键,待压力稳定在0.2kPa,长按微滴生成仪启动键运行;运行结束后,小心取出芯片,丢弃硅胶盖,观察第二行标本是否全部液压至第三行,观察第三行液面是否有明显白色油状物
裁剪尺寸合适的PCR板,两边各留一列空白孔,缓慢吸取第三行内的油水混合物转移至PCR板内,缓慢打下液体; 裁剪尺寸合适的铝膜,红线端朝上覆盖在PCR板上,打开封膜仪,点击封膜,封膜结束后,关闭所以仪器
打开朗基扩增仪A300 ②号机,选择XHD程序、标准模式,点击开始进行扩增
打开QuantDorp-Pro-4软件,点击灌洗,打开舱门,抬起固定卡扣,取出上板,放置PCR板,盖上上板,关闭卡扣,关闭舱门; 按对应孔位编辑待测标本名称及通道基因名称,保存后点击运行
根据同批次检测的阴阳对照确定阈值线大致位置:通道1/2阈值6000-7000,通道3/4阈值3000-4000; 导出程序:PC-E-PCR-Data-fcs-日期,导出结果和输出报告至U盘里
试剂盒及标本有效性判读
观察一维图、二维图不同通道的微滴荧光基团分离效果是否好
芯片总微滴数≥50000,CY5通道拷贝数≥100
阳性对照品甲基化比例:FAM通道≥10%,VIC通道≥40%,CY5.5通道≥40%; 阴性对照品甲基化比例:FAM、VIC、CY5.5均≤1%
标本检测结果判断
甲基化比例计算公式:目的基因拷贝数/(目的基因拷贝数+内标基因拷贝数)
注意: 不要吸到沉淀思维导图模板大纲
注意:阴阳对照洗脱量暂未定下; 阴性洗脱量30uL,阳性洗脱量60uL。思维导图模板大纲
注意:阴阳对照加入量暂未定下; 阴性20uL+25uL水,阳性45uL。思维导图模板大纲
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