人B、N、C基因甲基化联合检测思维导图
人B、N、C基因甲基化联合检测
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思维导图大纲
人B、N、C基因 甲基化联合检测思维导图模板大纲
血浆分离
送检外周血标本：离心3000rpm/10min，吸上清至EP管
高速离心12000rpm/10min吸上清至新的EP管，开始实验
送检血清标本：
已高速离心的血清标本，化冻后离心12000rpm/3min吸上清至EP管，开始实验
未高速离心的血清标本，化冻后离心12000rpm/10min吸上清至EP管，开始实验
DNA提取(试剂盒离心柱型CE)
准备10mLEP管，150uL胰脂肪酶+1500uL标本，涡旋震荡混匀后，室温静置5min
加入150mL蛋白酶K和2700uLbufferA，上下颠倒混匀后，瞬离至3000rpm即按停
水浴70 ℃孵育15min
加入预冷1500mL异丙醇，上下颠倒混匀10次，瞬离至3000rpm即按停，-20℃冰箱内孵育5min
吸取835uL标本加入吸附柱（绿色）中，离心12000rpm/1min，重复步骤，直至标本全部过柱收集离心完毕
加入预冷600uL漂洗液Ⅰ，离心12000rpm/1min，弃废液
加入预冷600uL漂洗液Ⅱ，离心12000rpm/1min，弃废液
将吸附柱置于新的收集管中，空甩离心12000rpm/3min
将吸附柱置于新的离心管中，开盖晾干3min
向吸附膜中央悬空滴加53uL洗脱液，室温静置3min，离心12000rpm/2min，将收集到的洗脱液再次加入到吸附膜中，进行重复洗脱，收集DNA并测浓度、纯度及做好记录
亚硫酸氢盐转化
配置转化液： 转化液干粉+750uL水+210uL缓冲液 涡旋震荡10min
20uL阴性对照品+25uL水，45uL阳性对照品，45uL标本，各加入5uL缓冲液，配置成50uL体系，金属浴37℃孵育15min
加入100uL转化液， 金属浴50℃避光孵育12-16小时
孵育完成后瞬离，4℃冰箱孵育10min，瞬离
向吸附柱（白色）中加入400uL结合液，标本转移到吸附柱中，上下颠倒混匀10次，离心12000rpm/30s，弃废液
加入100uL漂洗液， 离心12000rpm/30s，弃废液
加入200uL脱磺液，室温孵育18min后， 离心12000rpm/30s，弃废液
加入200uL漂洗液， 离心12000rpm/30s，弃废液，重复步骤
将吸附柱置于新的收集管中，空甩离心12000rpm/3min
将吸附柱置于新的离心管中，开盖晾干5min
向吸附膜中央悬空滴加20uL洗脱液，室温静置3min，离心12000rpm/2min，收集Bis-DNA；
试剂准备
配置反应体系：PCR反应预混液10uL/1人份+引物探针混合液4uL/1人份
充分混匀后14uL/管分装至八联管中
往八联管孔中加入6uLBis-DNA，共20uL体系，盖紧管盖，瞬离，避免气泡
数字PCR
打开气压原、微滴生成仪、封膜仪电源开关；取微滴生成芯片装配至配套底座，向芯片孔第一行加入50uL微滴生成油，第二行加入20uL产物，向产物上悬空滴加5.3uL密封剂，盖上配套的硅胶盖
打开气压原启动键，待压力稳定在0.2kPa，长按微滴生成仪启动键运行；运行结束后，小心取出芯片，丢弃硅胶盖，观察第二行标本是否全部液压至第三行，观察第三行液面是否有明显白色油状物
裁剪尺寸合适的PCR板，两边各留一列空白孔，缓慢吸取第三行内的油水混合物转移至PCR板内，缓慢打下液体； 裁剪尺寸合适的铝膜，红线端朝上覆盖在PCR板上，打开封膜仪，点击封膜，封膜结束后，关闭所以仪器
打开朗基扩增仪A300 ②号机，选择XHD程序、标准模式，点击开始进行扩增
打开QuantDorp-Pro-4软件，点击灌洗，打开舱门，抬起固定卡扣，取出上板，放置PCR板，盖上上板，关闭卡扣，关闭舱门； 按对应孔位编辑待测标本名称及通道基因名称，保存后点击运行
根据同批次检测的阴阳对照确定阈值线大致位置：通道1/2阈值6000-7000，通道3/4阈值3000-4000； 导出程序：PC-E-PCR-Data-fcs-日期，导出结果和输出报告至U盘里
试剂盒及标本有效性判读
观察一维图、二维图不同通道的微滴荧光基团分离效果是否好
芯片总微滴数≥50000，CY5通道拷贝数≥100
阳性对照品甲基化比例：FAM通道≥10%，VIC通道≥40%，CY5.5通道≥40%; 阴性对照品甲基化比例：FAM、VIC、CY5.5均≤1%
标本检测结果判断
甲基化比例计算公式：目的基因拷贝数/（目的基因拷贝数+内标基因拷贝数）
注意： 不要吸到沉淀思维导图模板大纲
注意：阴阳对照洗脱量暂未定下； 阴性洗脱量30uL，阳性洗脱量60uL。思维导图模板大纲
注意：阴阳对照加入量暂未定下； 阴性20uL+25uL水，阳性45uL。思维导图模板大纲
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