RNAi思维导图

1.2.3 RNAi在线虫中的应用

线虫作为模式线虫，已成为许多试验青睐的研究对象。因为它生命周

期短，易于在体外生存，可以快速生产大量的虫体材料。此外，线虫的研

13 究背景相当丰富，

系统性分析基因的功能提供了坚实平台。除上述优势外，线虫还具备其他

特性特别适合RNAi实验研究。线虫RNAi实验比较简单，典型的RNAi实

验包括两步：用dsRNA处理两性成虫；检查其子代的表型特征。通过dsRNA

处理后，线虫比其他动物更能有效的发生RNAi作用。

目前，线虫dsRNA的导入方法有：显微注射dsRNA、在dsRNA中浸泡线

虫 (Timmons等 ,1998)、使用表达 dsRNA的细菌喂养线虫及稳定转化法

（Timmons,2001; Kamath,2000）。

1.2.3.1显微注射法

显微注射法是最初的RNA干扰试验采用的经典方法，通过直接注射

dsRNA到雌雄同体线虫的生殖器官，进入生殖器官后dsRNA很容易在干细

胞中扩散引起RNAi，这种效应可以传递到子代。Timmons等（1998）在

研究中发现RNAi具有扩散性，将双链RNA注射到线虫的某一部位后可以

在全身其它细胞中看到干涉现象。这种方法产生的表型外显率高，但不足

之处在于效率低，不适合用此法进行高通量筛选，同时干扰效果会随着细

胞分裂而不断降低，也不适合进行晚期表达基因研究，另外，注射法需要

体外合成dsRNA和手工注射操作，比较费时，很难用于对大量处理对象进

行多个基因的大规模功能分析。

1.2.3.2 浸泡法

浸泡法则是将线虫浸泡在dsRNA溶液中，然后分析线虫的表型变化。

该法可以同时对大量线虫材料进行处理，扩大了实验规模。但因为浸泡法

需要体外合成大量的dsRNA，所以缺点是费钱，而且干扰成功率不高。2005

年，Rosso通过浸泡的方法使根结线虫摄入含有其唾液腺基因的dsRNA，

发现能有效引发根结线虫相应基因的基因沉默。

1.2.3.3 饲喂法

饲喂法是给线虫饲喂表达dsRNA的大肠杆菌，从而产生RNA干扰效

果，该方法成功率近似于微注射，可大批量培养，成本低，主要的缺点是

需要在细菌中表达dsRNA。不过目前已有86%的线虫基因有现成的菌株可

用，而且菌株可以反复使用无数次，极大的降低了研究成本。

1.2.3.4 稳定转化法

14 稳定转化法是建立在转基因技术之上，将函折叠重复靶序列的质粒转

入线虫，从而体内转录生成发夹型RNA分子进入RNAi途径。研究发现，

对于生活史晚期和神经组织相关基因的RNAi研究，这种方法比前三种方

法更能有效地检测到线虫的表型变化。Huang Guozhong等人（2005）证明，

用dsRNA喂食线虫，能引起线虫相关基因的沉默，并且将dsRNA注射到拟

南芥上，拟南芥产生明显的RNAi抗虫作用。

1.3 抗根结线虫的育种进展

1.3.1 根结线虫的危害

根结线虫病害是严重制约世界农作物产量的重要病源线虫。根结线虫

包括90余种，寄主范围较广，受害严重的有葫芦科、茄科、花生等多种植

物（张芸，2005），传播途径多，是植物一种极难防治的土传性病害。病

害发生后，一般每年引起产量损失达10%～15%，严重时损失达30%～

40%，甚至绝产（赵鸿，2005）。引起蔬菜根结线虫病的主要有四种，即

南方根结线虫、北方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫。

根结线虫的二龄幼虫侵入植物根部后，进入维管束向上移动，通过诱

导植物细胞分裂，形成巨大的、具有多细胞核的细胞:巨型细胞（GC，Giant

cell），并在此建立永久的取食据点（NFS，nematode feeding site）。根结线

虫通过从巨型细胞汲取营养和水分，生长发育为成虫。这个过程不但与植

株竞争养分，而且根结阻碍植物水分及营养的运输，严重危害植物生长。

同时，根结线虫的侵染为其它微生物的侵入创造了条件.

随着保护地栽培技术的推广，复种指数增加使得蔬菜根结线虫病根结

线虫病的的发生危害逐年加重，根结线虫的发生使蔬菜产量大幅度降低，

给农民造成严重损失，目前根结线虫的防治方法主要有化学防治、农业防

治和生物防治等方法，但这几种方式都存在一定的缺陷，从而限制了它们

的广泛使用。化学药剂毒性强，残留高，对环境污染大，不仅增加了成本，

对人类健康也不利，目前一大批线虫杀线剂被禁用；由于物种的引进或改

变对某一地区带来的生态影响是复杂和难以预料的，且生物本身往往存在

着一定地域性和寄生特异性，因此生物试剂不宜大面积推广；由于线虫在

土壤中寄生的时间可以长达十多年，使得作物轮作往往不能奏效或者只对

有限地域有限作物起有限作用；推广抗线虫品种是一种有效的防治线虫的

15 16

策略，但抗线虫种质往往是携带产量低等不利性状的野生资源，将抗源转

育到有潜力的优良材料中，培育成优良的抗病品种，不仅延长了选育周期，

而且一旦优势小种发生变异或劣势小种变为优势小种，立即会使得长期选

育的品种无法被利用，病原菌一旦侵染，其扩散的速度往往比选育的速度

快的多（Herrera-Estrella等，1999；翟文学等，1996）。

1.3.2 抗根结线虫策略的分子研究

近年来，随着对线虫侵染的方式、植物自身抗病防御体系研究的不断

深入，以及分子生物学理论和生物工程技术的不断发展，人们开始利用从

分子水平来研究线虫并进行了抗线虫的分子育种。

根结线虫的生活史包括线虫的侵入、取食和繁殖等几个阶段，而每个

阶段的被破坏都可以达到抗线虫的目的。一种方法是利用植物抗体或抗体

片断来结合并封闭线虫的分泌物达到抗线虫的目的；还可以利用植物蛋白

酶抑制剂干扰线虫的取食和消化；另外还可以阻止根结线虫诱导巨细胞的

形成，从而破坏其结构或在巨细胞中表达线虫毒性基因达到抗线虫的目的

（魏振林等，2007）。

1.3.3 蔬菜抗根结线虫研究进展

危害黄瓜的根结线虫主要是南方根结线虫、北方根结线虫、爪哇根结

线虫和花生根结线虫四种，而栽培黄瓜品种都抗北方根结线虫，而不抗南

方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫，因此育种者们试图将黄瓜属

野生种的抗线虫基因转入栽培种中，但由于种间的染色体数目不同（除黄

瓜n=7外，其他种的染色体数目多为n=12），利用传统的杂交方法十分困难，

而且抗线虫基因大多来自野生或半野生种属，而且常与不良的农艺性状连

锁，因而黄瓜的抗线虫育种上较其他作物进展缓慢。目前为止国外测试的

数百份黄瓜材料均未发现四种根结线虫都抗的（Winstead，1956；Walters，

1993），Walters 和Wehner（1996）育成的几个抗线虫的黄瓜品种不是商

品性不好，就是只能作为加工品种，且都不抗南方根结线虫。国内，顾兴

芳等人（2006）将108份黄瓜嫁接砧木进行抗南方根结线虫能力鉴定，结

果发现，以野生瓜棘瓜为砧木的黄瓜嫁接苗抗南方根结线虫能力强。

在番茄中，存在抗根结线虫基因Mi基因，Mi基因显性基因控制着番

茄对南方根结线虫的抗性，Mi基因是所有番茄栽培种的唯一抗源，许多野生番茄中均含有该基因，这种抗性基因具有广谱抗性，能有效地抗几种

根结线虫。目前已从番茄中一共发现9个抗根结线虫的基因Mi-1， Mi-2，

Mi-3，Mi- 4，Mi-5，Mi-6，Mi-7，Mi-8，Mi-9。Mi-1被定位在番茄的第6

染色体上，单个的显性位点Mi-3对南方根结线虫的毒性群体表现抗性，它

被定位在12染色体的远端，与热稳定性抗南方根结线虫基因Mi-5紧密连

锁。此外还发现Mi-2与Mi-8连锁、Mi-6与Mi-7连锁。Mi-2， Mi-4，Mi-5

和Mi-6基因耐高温， 在土壤温度达到32℃条件下，还维持对南方根结线

虫的抗性，而Mi-7和Mi-8在25℃条件下，对Mi基因有毒性的南方根结线

虫群体表现抗性，这些抗性基因为番茄抗根结线虫的育种提供了丰富的遗

传资源（彭德良，2001）。目前许多发达国家都相继从秘鲁番茄中引入

Mi基因，选育出抗根结线虫的栽培番茄。Am-mati，Cop分别利用胚培养

成功地将抗性基因转入杂种中，并获得抗性植株。Kaloshian等（1998）用

定位克隆的方法从野生番茄Lycoperisicon peruvianum中分离到Mi基因，然

后用DNA重组技术将Mi基因定位于番茄第6染色体上的一小段区域中，通

过对连续52KbDNA的序列分析，得出抗北方根结线虫外的其他3种根结线

虫的番茄栽培种。 Williamson等（1996）将野生番茄品种的抗根结线虫病

基因Mi转入普通番茄，转化的番茄植株能抗根结线虫病。我国目前也在

开展这方面的研究工作，据于秋菊等（1999）报道已经筛选出了一批抗番

茄根结线虫材料，其中对南方根结线虫免疫材料2个，高抗材料4个，强抗

材料4个，中抗材料2个，并正在加以利用。华中农业大学也选择出一批抗

番茄根结线虫材料（蔡福民， 2000），刘维信等（2000）报道筛选出3份

对番茄根结线虫免疫的材料。赵泓等（2004）运用胚珠培养法，以含Mi-3

基因的秘鲁番茄为父本，与栽培番茄杂交，获得了具有非温敏抗根结线虫

病基因Mi-3的种间杂种。

目前报道的关于辣椒根结线虫病的研究大多是国外研究。Martin

（1948）在1948年首次报道了辣椒品种对根结线虫的抗性，标志着辣椒抗

根结线虫育种的开始。在辣椒属中存在多个抗性基因，Hare于1957年首次

报道了辣椒对南方根结线虫的抗性是由单显性基因控制的，并将他发现的

第1个抗根结线虫的基因命名为N，此基因抗南方根结线虫、爪哇根结线

虫和花生根结线虫，在28℃以上会丧失部分抗性。Hendy等（1985）通过

17 双单倍体群体，在PM217、PM687和Yolo W onder上共发现5个抗病显性基

因。1958年Martin选育出抗根结线虫的干椒品种。此后，人们通过各种育

种方式进行辣椒抗根结线虫育种，相继育成了一此抗病品种。1998年美国

农业研究局基因学家Fery利用回交转育方法培育出两个抗南方根结线虫

的辣椒新品种Charleston Bell和Carolina Wonder：它们具有抗性基因N，对

南方根结线虫具有较强的抗性（Fery，1998）。我国对辣椒抗根结线虫的

研究起步较晚，“十五”期间国家攻关项目才明确提出要选育抗根结线虫

的甜椒育种材料（张宝玺，2005），但目前并没有好的抗线虫的材料。

3.2 抗根结线虫基因的 RNA 干扰表达载体的构建

3.2.1 16D10 基因的克隆

为了获得根结线虫

线虫的黄瓜根系总 RNA，其电泳结果显示为四条带，如图 4。以此 RNA

为模板，用引物 16DTR，采用 RT-PCR 法，在感染线虫的黄瓜总 RNA 中

扩增出 300 bp 左右与预期片段大小一致的特异性条带（见图 5），然后回

收该片段。将该目的片段连接到与 pMD18-T 载体上，得到载体

pMD-16D10， PCR 鉴定证实获得的 300 bp 左右的条带，跟预期目的片段

大小一致（图 6），进一步用

段，也与预期目的片段大小一致（图 7）。

图4 总RNA提取

Fig 4 Total RNA of cucumber root

1：不带根结的黄瓜根RNA

2,3：带有根结的黄瓜根RNA

图5 16D10基因的RT-PCR结果

Fig 5 RT-PCR product for 16D10

M:Marker DL2000

1. 水

2. 健康黄瓜根总RNA RT-PCR扩增结果

3. 感染根结线虫黄瓜根总RNA RT-PCR扩

增结果

图6 pMD18-16D10的PCR鉴定

Fig6：Identification of plasmid PCR(a) for

pMD18-16D10

M：MarkerDL2000；

1：pMD18-16D10的PCR结果；

2：ddH2O；

图7 pMD18-16D10的酶切鉴定

Fig 7：Restriction analysis for pMD18-16D10

M：MarkerDL2000；

1-3：pMD18-16D10/

经上海生物工程公司进行测序，测序结果与已经公布的南方根结线虫

的序列只有两个碱基的不同，同源性达 99%以上（图 8）。

43 44

图8 16D基因的同源性分析

Fig.8 Homology analysis of 16D with southward nematode

Upper line: article incognita.seq， from 1 to 337

Lower line: pMD-16D， from 1 to 336

article incognita.seq:yu identity= 99.70%（335/336） gap=0.30%（1/337）

1 GAGAAAATAAAATATAAATTATTCCTCAAAAATACCATAAAGTTAATTATTCTTCAATCA

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

1 GAGAAAATAAAATATAAATTATTCCTCAAAAATACCATAAAGTTAATTATTCTTCAATC.

61 AAAAAATGTTTACTAATTCAATTAAAAATTTAATTATTTATTTAATGCCTTTAATGGTTA

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

60 AAAAAATGTTTACTAATTCAATTAAAAATTTAATTATTTATTTAATGCCTTTAATGGTTA

121 CTTTAATGCTTTTGTCTGTCTCATTTGTGGATGCAGGCAAAAAGCCTAGTGGGCCAAATC

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

120 CTTTAATGCTTTTGTCTGTCTCATTTGTGGATGCAGGCAAAAAGCCTAGTGGGCCAAATC

181 CTGGAGGAAATAATTGAAGAAAAATGATTGAAGAAAAACGTTTAAATTAAACGATAAATG

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||

180 CTGGAGGAAATAATTGAAGAAAAATGATTGAAGAAAAACGTTTAAATTAAATGATAAATG

241 GGAAATAATGGAATTTAAATTAAGCTAATTTTGATGGTTTCCTTTGTTAATTTCAACATA

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

240 GGAAATAATGGAATTTAAATTAAGCTAATTTTGATGGTTTCCTTTGTTAATTTCAACATA

301 AAATTAATTGAATTTACTGAATAAAATTATATCTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||

300 AAATTAATTGAATTTACTGAATAAAATTATATCTGAA

载体 pBLUE-22 的构建：以含 16D10 基因的 T 载体为模板，然后用

引物对 16D10i-22-F 和 16D10i-22-R 扩增反义基因片段，结果表明，所得

到的扩增条带均为单一条带，其大小为 270 bp 左右，与预期的目的片段

的大小基本一致。将反向 PCR 产物用

样用这两种酶进行酶切后的 pBLUE-Nir 载体上，命名为 pBLUE-22， 然

后对 pBLUE-22 质粒用

左右的片段，与预期大小一致，表明已经成功将反义片段连入 pBLUE-Nir

载体上（图 9）。

图9 pBLUE-22的酶切鉴定

Fig 9: Restriction analysis for pBLUE-22

M：MarkerDL2000；

1：pBLUE-22/

载体 pBLUE-22-21 的构建：采用同样的技术策略，再将正向 PCR 产

物用

命名为 pBLUE-22-21，用

的片段，酶切后电泳检测得到了 800 bp 的片段，与预期大小一致，而

pBLUE-22 酶切后是 500bp 的带，表明已将 16D10 基因正向连入 pBLUE-22

载体中（见图 10）。

45 46

3.2.3 中间克隆载体的构建

将 pBLUE-22-21 用

上述两种酶酶切的 pRTL2 连接，命名为 pRTL2-22-21。用

应得到2000 bp的带，电泳结果表明所获得的条带与理论值相符（见图11），

表明目的片段已连入 pRTL2 中。

3.2.4 植物表达载体的构建

将 pRTL2-22-21 用

进行酶切的 pBIN19 载体连接。用

的带，电泳结果表明所获条带的大小与理论值相符，表明目的片段已连入

图10 pBLUE-22-21载体的酶切鉴定

Fig 10: Restriction analysis for pBLUE-22-21

M. λDNA/

1. pBLUE-22-21/

/

(约0.8kb)

2. pBLUE-22/

/

(约0.5kb)

M：.λDNA/

1: pRTL2/HindⅢ(约1.2kb)

2: pRTL2-22-21/HindⅢ (约2.0kb)

图11 pRTL2-22-21载体的酶切鉴定

Fig 11:Restriction analysis for pRTL2-22-2147

植物表达载体 pBIN19 中（见图 12）

5.2 抗根结线虫的 RNAi 表达载体构建

构建了能形成双链的 pBLUE-22-21 载体，并将此双链基因插入到由

35S 启动子调控的克隆载体 pRTL2 上，命名为 pRTL2-22-21，再将含有启

动子和终止子以及双链的目的片段插入到双元表达载体 pBIN-19 上，得到

表达载体 pBIN-22-21。