2 Materials and methods思维导图

2.1 数据来源与基因差异分析

利用基因表达综合数据库(GEO) (GSE36830和GSE23552数据集)挖掘CRSwNP患者和正常人的基因表达谱。所涉及到的生物信息学分析均使用R(4.4.1）语言完成。在差异分析中，选取｜logFC｜>2且矫正后P<0.05作为筛选标准，使用R的“limma”包鉴定差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。DEGs的热图和火山图分别使用“Pheatmap”R包和“ggplot2”R包绘制。

2.2 GSEA分析比较正常组织和慢性鼻窦炎伴鼻息肉组织的生物通路差异

该方法通过关注基因集（即具有共同生物学功能、染色体位置或调控的基因组）来获得其结果[0]。在本研究中包含两部分，即GO分析与KEGG分析，测试在Control组与Treat组中不同生物通路基因的表达量差异。

2.3 构建加权基因共表达网络，筛选基因作为候选基因。

首先进行数据预处理，包括数据的标准化、缺失值处理和异常样本的检测与排除。使用Pearson相关系数计算任意两个基因之间的相关性，并通过幂函数（soft thresholding）处理这些相关系数，以构建网络。加权基因共表达网络分析(Weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)通过识别样本中基因共表达关系来识别潜在的基因相互作用和与表型的相关性，用于探索基因表达谱与表型之间的复杂关系[1]。采用R软件的WGCNA包(version 1.72-5），根据加权相关系数构建所选基因之间的网络，并计算网络中每个基因的连接度。通过聚类分析将基因分组到所谓的模块中，这些模块包含表达模式相似的基因[2]。采用R绘图包绘制各个颜色模块散点图。同时，我们还采用R绘图包绘制了模块-疾病相关性热图，选择了最相关的模块作为WGCNA衍生的中心基因。

2.4 通过PPI网络分析蛋白质相互作用，从候选基因中筛选出标志基因

通过IRG方法，我们筛选出慢性鼻窦炎伴鼻息肉中相关的免疫调控基因，将差异分析、IRG与WGCNA的结果通过工具Venn图(https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)鉴定出交叉部分的基因，作为候选基因来进行后续筛选。

我们使用保存的候选基因数据，通过STRING数据库（https://string-db.org/）检索了编码蛋白间可能的潜在相互作用，并构建蛋白质相互作用网络表示出来，目的是描述这些基因或蛋白之间存在怎样的相互关系，阐述生物体中有意义的分子调节网络[6]。通过cytoscape软件，计算Degree值，根据Degree值排序取前五位并进行可视化，我们期望筛选得到hub基因。

2.5 对筛选到的基因进行GO和KEGG富集分析

京都基因与基因组百科全书(KEGG)是了解高级功能和生物系统(如细胞、生物和生态系统)、用于研究通路的数据库之一[3]。Gene Ontology (GO)则包括生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)三个组成部分。为了探究候选基因的生物学功能和相关通路，我们利用R(4.4.1)，对候选基因做了GO和KEGG富集分析，计算P值[4-5]。

2.6 对hub基因进行诊断价值的评估

通过R包绘制的ROC曲线评估hub基因的诊断价值[7]。为进一步直观体现hub基因在慢性鼻窦炎伴息肉患病风险方面的影响，我们使用R的rms包绘制了预后列线图，并绘制了标准曲线排除过拟合因素造成的误差。

2.7 免疫浸润分析和免疫功能分析

在TCGA数据库下载fpkm数据，使用R中的limma包校正mRNA表达矩阵，并且将多个同一基因的表达值取平均值，以获取唯一的mRNA，避免对后续的操作有干扰[8]。

利用CIBERSORT工具里面的LM22文件，将mRNA表达谱转化为在对应组织中22种免疫细胞的所占比例。使用R包绘制免疫细胞热图，显示所有样本的免疫细胞分布情况。

接下来，绘制22种免疫细胞在Control组和Treat组表达量的差异图，计算P值大小，观察是否具有统计学意义。

2.8 联合孟德尔随机化鉴定预后标志物（待定）

孟德尔随机化(MR)是近年来推广的一种可靠的方法，用于推断潜在的因果关系，这种方法利用了遗传变异作为“工具变量”，这些变异在人群中的分布类似于随机分配，类似于临床试验中的随机分组。通过分析这些遗传变异与表型之间的关联，研究人员可以推断出表型与疾病之间可能的因果联系，而不仅仅是相关性。这种方法有助于减少混杂因素的影响，提供更有力的因果证据[9-11]。

使用单核苷酸多态性(snp)作为工具变量(IVs)来评估暴露因素与结果之间的因果关系。MR使用与暴露因素密切相关的遗传变异作为工具变量来推断暴露因素与研究结果之间的因果关系。设暴露因素X为hub基因，结局变量Y为慢性鼻窦炎伴鼻息肉。通过GWAS数据库找到暴露因素X和结局变量Y的SNP数据，再通过R处理数据，然后使用五种方法(MR Egger,Weighted median,Inverse variance weighted,Simple mode和Weighted mode）进行MR分析。

接下来对孟德尔随机化的结果进行敏感性分析，使用R的TwoSampleMR包进行异质性检验，根据结果判断存在是否异质性。进行多水平效应检验，判断是否存在多水平效应。然后，进行Leave-one-out analysis，观察逐步剔除SNP后观察剩余的稳定性[12]。

[0]Subramanian A, Tamayo P, Mootha VK, Mukherjee S, Ebert BL, Gillette MA, Paulovich A, Pomeroy SL, Golub TR, Lander ES, Mesirov JP. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Oct 25;102(43):15545-50. doi: 10.1073/pnas.0506580102. Epub 2005 Sep 30. PMID: 16199517; PMCID: PMC1239896.

[1]Langfelder P, Horvath S. WGCNA: an r package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinf (2008) 9:559. doi: 10.1186/1471-2105-9-559

[2]Zhou X, Zhen X, Liu Y, Cui Z, Yue Z, Xu A, Han J. Identification of Key Modules, Hub Genes, and Noncoding RNAs in Chronic Rhinosinusitis with Nasal Polyps by Weighted Gene Coexpression Network Analysis. Biomed Res Int. 2020 Jan 23;2020:6140728. doi: 10.1155/2020/6140728. PMID: 32047813; PMCID: PMC7003281.

[3]Kanehisa M, Sato Y, Morishima K. BlastKOALA and GhostKOALA: KEGG Tools for Functional Characterization of Genome and Metagenome Sequences. J Mol Biol. 2016 Feb 22;428(4):726-731. doi: 10.1016/j.jmb.2015.11.006. Epub 2015 Nov 14. PMID: 26585406.

[4]Zhao Y, Wang J, Chen J, Zhang X, Guo M, Yu G. A Literature Review of Gene Function Prediction by Modeling Gene Ontology. Front Genet. 2020 Apr 24;11:400. doi: 10.3389/fgene.2020.00400. PMID: 32391061; PMCID: PMC7193026.

[5]Gene Ontology Consortium; Aleksander SA, Balhoff J, Carbon S, Cherry JM, Drabkin HJ, Ebert D, Feuermann M, Gaudet P, Harris NL, Hill DP, Lee R, Mi H, Moxon S, Mungall CJ, Muruganugan A, Mushayahama T, Sternberg PW, Thomas PD, Van Auken K, Ramsey J, Siegele DA, Chisholm RL, Fey P, Aspromonte MC, Nugnes MV, Quaglia F, Tosatto S, Giglio M, Nadendla S, Antonazzo G, Attrill H, Dos Santos G, Marygold S, Strelets V, Tabone CJ, Thurmond J, Zhou P, Ahmed SH, Asanitthong P, Luna Buitrago D, Erdol MN, Gage MC, Ali Kadhum M, Li KYC, Long M, Michalak A, Pesala A, Pritazahra A, Saverimuttu SCC, Su R, Thurlow KE, Lovering RC, Logie C, Oliferenko S, Blake J, Christie K, Corbani L, Dolan ME, Drabkin HJ, Hill DP, Ni L, Sitnikov D, Smith C, Cuzick A, Seager J, Cooper L, Elser J, Jaiswal P, Gupta P, Jaiswal P, Naithani S, Lera-Ramirez M, Rutherford K, Wood V, De Pons JL, Dwinell MR, Hayman GT, Kaldunski ML, Kwitek AE, Laulederkind SJF, Tutaj MA, Vedi M, Wang SJ, D'Eustachio P, Aimo L, Axelsen K, Bridge A, Hyka-Nouspikel N, Morgat A, Aleksander SA, Cherry JM, Engel SR, Karra K, Miyasato SR, Nash RS, Skrzypek MS, Weng S, Wong ED, Bakker E, Berardini TZ, Reiser L, Auchincloss A, Axelsen K, Argoud-Puy G, Blatter MC, Boutet E, Breuza L, Bridge A, Casals-Casas C, Coudert E, Estreicher A, Livia Famiglietti M, Feuermann M, Gos A, Gruaz-Gumowski N, Hulo C, Hyka-Nouspikel N, Jungo F, Le Mercier P, Lieberherr D, Masson P, Morgat A, Pedruzzi I, Pourcel L, Poux S, Rivoire C, Sundaram S, Bateman A, Bowler-Barnett E, Bye-A-Jee H, Denny P, Ignatchenko A, Ishtiaq R, Lock A, Lussi Y, Magrane M, Martin MJ, Orchard S, Raposo P, Speretta E, Tyagi N, Warner K, Zaru R, Diehl AD, Lee R, Chan J, Diamantakis S, Raciti D, Zarowiecki M, Fisher M, James-Zorn C, Ponferrada V, Zorn A, Ramachandran S, Ruzicka L, Westerfield M. The Gene Ontology knowledgebase in 2023. Genetics. 2023 May 4;224(1):iyad031. doi: 10.1093/genetics/iyad031. PMID: 36866529; PMCID: PMC10158837.

[9]Sekula P, Del Greco M F, Pattaro C, Köttgen A. Mendelian Randomization as an Approach to Assess Causality Using Observational Data. J Am Soc Nephrol. 2016 Nov;27(11):3253-3265. doi: 10.1681/ASN.2016010098. Epub 2016 Aug 2. PMID: 27486138; PMCID: PMC5084898.

[10]Emdin CA, Khera AV, Kathiresan S. Mendelian Randomization. JAMA. 2017 Nov 21;318(19):1925-1926. doi: 10.1001/jama.2017.17219. PMID: 29164242.

[11]Skrivankova VW, Richmond RC, Woolf BAR, Yarmolinsky J, Davies NM, Swanson SA, VanderWeele TJ, Higgins JPT, Timpson NJ, Dimou N, Langenberg C, Golub RM, Loder EW, Gallo V, Tybjaerg-Hansen A, Davey Smith G, Egger M, Richards JB. Strengthening the Reporting of Observational Studies in Epidemiology Using Mendelian Randomization: The STROBE-MR Statement. JAMA. 2021 Oct 26;326(16):1614-1621. doi: 10.1001/jama.2021.18236. PMID: 34698778.

[12]Pang S, Han T, Huang X, Zhao Y, Qian J, Zhong J, Xie P, Liao L. Exploring the potential causal relationship between gut microbiota and heart failure: A two-sample mendelian randomization study combined with the geo database. Curr Probl Cardiol. 2024 Feb;49(2):102235. doi: 10.1016/j.cpcardiol.2023.102235. Epub 2023 Nov 30. PMID: 38040216.