叶绿素的定量测定思维导图

谭云天2022319010427植保224

一、实验步骤

称取新鲜菠菜叶片0.20 g,剪碎置研钵中，加少量碳酸钙和石英砂，并加入1-2 mL 80%丙酮，研磨成匀浆，再加入4mL 80%丙酮，继续充分研磨，用少许丙酮湿润过的滤纸过滤，再用少量丙酮将滤纸和研钵上的色素冲洗干净，定容至10mL,摇匀。

吸取叶绿素丙酮提取液2 mL至试管中，加80%丙酮2 mL稀释后混匀，倒入比色杯中，以80%丙酮为空白对照，用分光光度计分别在波长645 nm、663 nm和652 nm下测定光密度值。

二、实验结果

D645=0.224 (稀释4倍)

D652=0.358（稀释4倍）

D663=0.619（稀释4倍）

D663=82.04Ca+9.27Cb

D645=16.75Ca+45.60Cb

叶绿素a浓度Ca=（12.7D663-2.59D645）=7.28（mg/L）

叶绿素b浓度Cb=（22.9D645-4.67D663）=2.24（mg/L）

叶绿素总浓度CT=Ca+Cb=9.52（mg/L）

用光密度D652计算：CT=1000×D652/34.5=10.38（mg/L）

叶绿素a含量 =4*（Ca*10mL）/（0.2g*1000）=1.092（mg/g）

叶绿素b含量 =4*（Cb*10mL）/（0.2g*1000）=0.448（mg/g）

叶绿素总含量 =4*（CT*10mL）/（0.2g*1000）=1.904（mg/g）

三、讨论

叶绿素a含量大于叶绿素b含量

叶绿素总含量大于叶绿素a加叶绿素b

在稀释叶绿素提取液时需要梯度稀释，防止稀释过度，OD值过小。

四、思考题

叶绿素a，b在蓝光去也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素a，b的定量分析？为什么？

红光：波长范围：7700～6400纳米；

蓝光：波长范围：450~435纳米；

紫光：波长范围：435~390纳米

不能采用蓝光吸收峰进行定量分析

这次试验是在红光区域测的，这是因为叶绿素a，b都在红光区有吸收，而类胡萝卜素也有蓝紫光的吸收。

难以排除类胡萝卜素吸收蓝紫光产生的影响。

叶绿体色素及其理化性质

叶绿体色素的提取

1、实验步骤：称取5.0g鲜菠菜叶片，剪碎后放人研钵中，加人5 mL 95%乙醇及少许CaCO3粉末和 石英砂研磨成匀浆，再加人15 mL 95%乙醇搅拌均匀，将研磨液用滤纸过滤至25 mL试管中，滤液即为叶绿体色素的粗提液，呈深绿色，内含叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素、叶黄素，以及其他脂溶性物质，保存此液备用。

叶绿素的荧光现象

实验步骤：

直接取含有叶绿体色素提取液的试管，分别观察反射光和透射光的颜色，记录并分析观察到的实验现象。

结果

用光照射试管里的液体，在光源同侧看液体是暗红色的，在光源的异侧看液体是绿色的。

讨论：

观察荧光效应时现象不明显，推测为荧光较弱环境光较强的原因

叶绿素的皂化作用

1、实验步骤：

实验组：取3 mL叶绿体色素提取液，加人1 mL 20% KOH-甲醇溶液，充分摇匀。放置片刻 后，加人3 mL苯，混合后沿试管壁慢慢加人1 mL蒸馏水，得到三层溶液，上层是苯溶液，下层是稀的乙醇溶液，试管底部同时出现白色沉淀，这是乳化现象。如果充分摇匀后再将试管放置在30~40C水浴中，乙醇层溶液很快清澈透明。观察记录苯层和乙醇层的颜色，分析其中溶解的叶绿体色素类型，并说明原因。

对照组:另取3 mL叶绿体色素提取液，直接加入3mL苯和1 mL蒸馏水。记录苯层和乙醇层的颜色，分析其中溶解的叶绿体色素，并说明原因。

2、结果：

实验组由上到下依次为褐黄色（苯溶液），淡绿色（乙醇层）对照组由上到下只

3、讨论

将试管放置在30~40C水浴中，乙醇层溶液很快清澈透明，但是将试管取出一段时间后乙醇层又会变得浑浊，推测为温度影响了相关物质在乙醇中的溶解度。

叶绿素于类胡萝卜素的吸收光谱

实验步骤：

首先调节分光镜，能在镜简中清晰地观察到光源的连续光谱，然后分别观察叶绿素(皂化反应后的乙醇层溶液)和类胡萝卜素提取液(皂化反应后的苯层溶液)的吸收光谱。将观察到的结果用不同颜色的笔绘图表示。

在皂化作用中的实验组，用叶绿素（乙醇层）对着棱镜。可以看到红色和蓝紫色都有所减弱。

可以看到蓝紫色条带被吸收了一部分。

结论：

叶绿素对于红光和蓝紫光都有吸收，而类胡萝卜素对蓝紫光吸收比较明显。

3、讨论：

观察时不要晃动试管，防止影响观察

氢和铜对叶绿素中镁的取代作用

1、实验步骤：取5 mL叶绿素提取液至试管中，加入1滴浓盐酸，摇匀，观察溶液颜色的变化，记录现象，分析原因。

另取1支试管，倒人一半上述变色的溶液，加入少许乙酸铜结晶，在酒精灯上徐徐加热，观察溶液颜色变化，记录现象，分析原因。

2、结果：加了浓盐酸后，液体有绿色转为红褐色。加了乙酸铜加热后由红褐色变为翠绿色。

思考题：

用新鲜叶片提取叶绿素时，为什么一定要加入一定量的碳酸钙？

作为还原剂，保护叶绿素不被酸氧化。

叶片的液泡里有许多有机酸，会破坏叶绿素，碳酸钙可以通过反应掉酸提高pH，让叶绿素尽可能完好的被提取出来。

对着光源和背着光源观察时，叶绿素提取液的颜色为何不同？

用白光照射叶片。对着光源的时候观察到的是透射光，白光里的红光和蓝紫光被吸收，因此对着光源显示出绿色。

背着光源的时候，看到的是叶片自己射出的荧光。反射光是白光，对观测影响小。荧光是叶片色素吸收蓝光，由最低激发态，发射红光变成基态过程中发射的，显示红色。因此背着光源看到红色。

叶绿素和类胡萝卜素分子的吸收光谱有何不同？

叶绿素主要吸收红光和蓝紫光。而类胡萝卜素主要吸收和蓝紫光。

植物叶绿素荧光参数的测定

一、实验步骤

1.选择正常生长的植物叶片，保持叶片清洁，使用暗适应叶夹夹住一个叶片， 关闭

叶夹上滑板，暗适应30 min。

2.打开0S-30p+叶绿素荧光测定仪，进入主菜单，选择Fv/Fm -FvF/0 模式。

3.设定调制光光强、饱和光光强和饱和脉冲宽度等参数。

4.分别测量并记录对照及逆境处理植物的F0、Fm、Fv、Fv/Fm Fv/F0等参数。

荧光参数

处理

第1组

第2组

第3组

第4组

第5组

第6组

第7组

第8组

第9组

第10组

平均值

标准误差

Fo

干旱

305

303

418

390

321

428

308

326

276

362

343.7

52.64778

正常

292

407

370

277

198

242

218

212

183

242

264.1

74.04421

Fv

干旱

798

782

741

828

991

1254

947

991

953

1431

971.6

219.1865

正常

1104

1325

1469

1340

1017

1112

1020

1038

874

1000

1129.9

186.7306

Fm

干旱

1030

1085

1159

1218

1312

1682

1255

1317

1229

1793

1308

245.303

正常

1717

1732

1839

1617

1215

1354

1238

1250

1057

1242

1426.1

273.1318

Fv/m

干旱

0.725

0.72

0.639

0.679

0.755

0.745

0.754

0.752

0.775

0.798

0.7342

0.046416

正常

0.791

0.765

0.798

0.828

0.837

0.821

0.823

0.83

0.826

0.805

0.8124

0.022352

Fv/o

干旱

2.62

2.58

1.772

2.123

3.087

2.929

3.074

3.039

3.452

3.953

2.8629

0.627346

正常

3.79

3.255

3.97

4.837

5.136

4.595

4.678

4.896

4.775

4.132

4.4064

0.593863

二、实验结果：

暗处理的F0明显比光处理的高。光处理的Fm，Fv/Fm，Fv//F0都比暗处理的高。

F0表示暗适应PSⅡ中心全部开放时的荧光强度。

Fm表示暗适应PSⅡ中心全部关闭时的荧光强度。

FV=Fm-F0表示光合过程中可能传递的能量

Fv/Fm：经过充分暗适应的植物叶片PSⅡ最大的量子效率指标。

Fv/F0：间接表示PSⅡ反应中心的能量捕捉效率。

三、讨论：

荧光+光化学+热=1，热基本不变，荧光越多，用于光化学的能量越少。

受到暗处理的植株F0显著提高，Fm显著下降。也就是说，如果不光合会浪费掉不少的荧光能量，但是一光合就能更高效的利用光能。

Fv/Fm差异不是很明显，这可能是PSⅡ决定的。

而Fv/F0暗处理后显著降低，则说明其捕捉光的能力下降了。

四、思考题：

与正常生长的对照相比，逆境植物测得的F0，Fm，Fv，Fv/Fm，Fv/F0有何差异？

F0更高Fm更低Fv更低Fv/Fm更低Fv/F0更低

根据实验结果说明逆境对于植物光合作用的影响。

逆境降低了光的利用率，对于光合作用起不利