p38激活的蛋白激酶信号转导通路介导的自噬在镉暴露的韩国臂尾轮虫中的作用思维导图
激活的蛋白激酶信号转导通路介导的自噬在镉暴露的韩国臂尾轮虫中的作用介绍
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思维导图大纲
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自噬
自噬可能在氧化条件下发挥关键的防御作用，通过清除累积和受损或异常的物质，因为氧化应激会引发包括 DNA、蛋白质和脂质在内的生物分子的损伤
主要消化具有异常和/或不必要功能的蛋白质，以回收物质和节省能量。在营养饥饿、缺氧和内质网（ER）应激等刺激下，自噬机制也被诱导以维持体内平衡
自噬相关 ( ATG ) 基因
在众多ATG中，包括ATG8 (LC3 I/II) 在内的核心ATG在动物分类群中是保守的，并且是自噬机制的重要组成部分
线虫秀丽隐杆线虫中，核心 ATG 在自噬体形成中的作用通过敲低核心atg-7和atg-12得到证实
在Atg8a突变体果蝇中，由于 Atg8a 缺陷抑制了囊泡扩张以形成自噬体，因此观察到寿命缩短，并积累了不溶性泛素化蛋白
LC3基因的鉴定与比对
对B. koreanus LC3 和人类 LC3 进行比对，以分析 LC3 抗体 (Sigma-Aldrich) 的表位位点。
使用来自人类的相似基因序列作为查询，从B. koreanus的全基因组数据库（未发表数据；总支架编号 1087；总长度 110 Mb；N50 值 1.09 Mb）中鉴定了B. koreanus的 LC3 基因的氨基酸序列。使用完整组装的转录本针对 NCBI 的非冗余 (NR) 数据库进行本地 BLAST 搜索 (BLASTp)。E 值 ≤10 −5的 BLASTp 匹配被认为是有意义的。
自噬
雷帕霉素
自噬激活剂
析 1 μM 雷帕霉素作用 1、3 和 6 小时后LC3 I/II 的水平，研究了朝鲜小麦自噬的保守性。此外，使用 400 nM bafilomycin A 1来验证自噬的抑制作用。
LC3 I/II 表达增加,自噬被激活
bafilomycin A1
自噬抑制剂
400 nM bafilomycin A 1来验证自噬的抑制作用。
LC3 I/II 表达降低，自噬被抑制
LC3 I/II 被检测为自噬的标志蛋白
酸性囊泡细胞器可视化
吖啶橙 (AO)
将轮虫（约 300 只）暴露于不同浓度的 Cd（10、20、30、40 和 50 mg/L）中 24小时，与 2 μg/mL AO 一起孵育10分钟，然后用 ASW 清洗三次。使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM；LSM 510 META；Zeiss，德国奥伯科亨）和 20 ×镜头检测 AO 荧光。绿色荧光的激发和发射波长分别为 473 和 520 nm，红色荧光的激发和发射波长分别为 559 和 572 nm。使用 Image J 软件（美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）分析红色和绿色荧光比率。
当 AO 与双链 DNA (dsDNA) 结合时会显示绿色荧光，而在低 pH 条件下与 AVO（包括自溶酶体和溶酶体）发生反应时会发出红色荧光--红绿比增加表明自噬细胞增加
AVO 是自噬的形态标志；这些染料在酸性囊泡内旋化时会积聚并形成聚集体并发出红色荧光，而在中性 pH 下观察到绿色 (AO) 或红色 (NR) 荧光
中性红 (NR)
暴露于 Cd 的轮虫在 100 mM NR 溶液中孵育 5分钟，并用 ASW 清洗三次。使用荧光显微镜（Olympus IX71；日本东京 Olympus Corporation）观察轮虫，并使用 Image J 软件量化红色染色区域。
NR 染色导致红黄荧光比增加，表明响应 Cd 暴露的 AVO 增加
免疫荧光
，根据实验将轮虫暴露于化学物质中，并用 4% 多聚甲醛固定 5 分钟。在 PBS-T 中清洗三次后，将固定的样品在封闭缓冲液（PBS-T 中的 0.5% BSA）中孵育 1 小时。将轮虫转移到一抗溶液（在封闭缓冲液中 1:500 稀释）中，在 4 °C 下孵育 48 小时 ，并在洗涤缓冲液中清洗三次，每次 1 小时。用 FITC 标记的山羊抗兔 IgG 抗体（Sigma-Aldrich；1:200 稀释的封闭缓冲液）替换洗涤缓冲液，并 在 4 °C 下孵育 24 小时。使用 FITC（488 nm/520 通过配备 20 × 镜头的共聚焦激光扫描显微镜对 100 nm 波长的样本进行分析。
在冠、营养层、卵黄囊和胃部周围观察到了免疫荧光；表明这些组织中的 LC3 I/II 水平升高。
切片观察
轮虫首先在室温下 用 2.5% 戊二醛在 0.1 M 磷酸盐（pH 7.3）中固定 1小时。固定后，在 4 °C 黑暗条件下用 1% OsO4 加 1.5% 亚铁氰化钾在 0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.3）中处理组织 1小时，然后在乙醇和环氧丙烷系列中脱水后嵌入 Epon 812（电子显微镜科学；美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德）。使用纯树脂在 70 °C 下进行聚合两天。使用超薄切片机（UltraCut-UCT，Leica，奥地利）获得超薄切片（70 nm），然后将其收集在 100 目铜网上。用 2% 醋酸铀酰（15分钟）和柠檬酸铅（5 分钟后，用 120 kV 透射电子显微镜 (Tecnai G2 Spirit Twin，赛默飞世尔科技，美国) 对切片进行检查。
观察到自噬体
ROS
细胞内 ROS 水平在 Cd 暴露后升高
WB
LC3 I/II 水平在 Cd 暴露后以与 ROS 水平类似的方式增加
MAPK信号通路的磷酸化状态
WB
ERK
ERK和JNK通过调节其下游信号通路来诱导自噬，这些信号通路主要与Beclin-1有关； ERK还通过mTOR介导的通路增强Beclin-1的活性，从而诱导自噬
JNK
在无应激条件下，Bcl-2与Beclin-1结合并抑制自噬，而当Bcl-2被JNK激活时，Bcl-2与Beclin-1分离
p-JNK
p38
p-p38
p-p38 的磷酸化水平以剂量依赖性方式增加，而 ERK 和 JNK 未检测到显著的磷酸化
p38 抑制剂 SP203580 和 30 mg/L Cd 共同处理轮虫
与仅暴露于 Cd 的组相比，SP203580 联合处理组的 LC3 I/II 降低（图 6B），表明p38 MAPK是自噬的上游信号通路。
MEK1/2抑制剂
jnk抑制剂sp600125
在ERK和JNK抑制的情况下，LC3 I/II水平不随Cd暴露而变化，而在无Cd暴露的情况下单独用抑制剂处理后，LC3 I/II水平降低（图6C），表明Cd诱导的自噬主要由p38 MAPK信号介导，而ERK和JNK参与基础自噬调控。
OS 清除剂存在下 p38 MAPK 的磷酸化状态
在 0.5 mM NAC 处理下，ROS 水平降至基础水平；p-p38 和 LC3 I/II 的水平与对照组相似
ROS 清除下的 LC3 I/II 免疫荧光
当 ROS 被 0.5 mM NAC清除时，暴露于 Cd 的朝鲜拟南芥中 LC3 I/II 的免疫荧光降低
p38 抑制下的 LC3 I/II 免疫荧光
当 p38 受到抑制时，免疫荧光也大多消失
沪公网安备 31011502019485号
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