气候变暖驱动的土壤溶解有机质分子组成跨深度变化——以青藏高原为例思维导图

1. 引言

在陆地生态系统中，土壤是一个巨大的碳库，其至少相当于大气碳(~ 750 Gt)和植被(~ 560 Gt)的总重量土壤碳库的动态变化与气候变化密切相关土壤有机质(SOM)是土壤碳库的主要组成部分，研究人员提出了土壤连续体模型来揭示土壤有机质的形成过程。该理论强调溶解有机质(DOM)是碳库的关键组成部分，在固碳中起着重要作用。DOM是一种复杂的非均质连续体，是可溶有机物质的一部分，可以通过0.45 μm的过滤器DOM的分子组成通常是基于光谱技术5 - 9和超高分辨率质谱来表征的。青藏高原的变暖速度大约是全球变暖速度的三倍高寒草地生态系统占青藏高原面积的60%以上，以高寒草甸为主要生态系统，对全球气候变化高度敏感高寒草甸土壤。DOM分子组成的变化可能对气候变暖更为敏感，因为DOM是土壤碳库中最活跃的成分此外，土壤DOM组成具有深度依赖性。15,16具体来说，底土中的DOM主要由碳水化合物和富氮化合物组成，而表层和近表层土壤中的DOM来源于木质素，并富含酚类化合物。与此同时，以前的研究已经报道，在气候变暖的情况下，土壤碳损失是深度依赖的然而，DOM分子组成对气候变暖的响应是否强烈依赖于深度尚不清楚。

以前研究证明DOM分子组成受到生物和非生物过程的影响。微生物在DOM的存在和转化中起着至关重要的作用。变形菌与化合物(H/C < 1.5)呈显著正相关，与脂肪族化合物(H/C < 1.5)呈显著负相关，4表明微生物对DOM的利用有偏好。水稻土DOM的分子组成受总碳(TC)、氨氮、硝态氮和ph值的影响。气候变暖影响了土壤微环境条件和微生物群落结构和活动，19−22可能影响了氧化转化和降解，最终影响了DOM的分子组成。然而，气候变暖条件下微生物和环境因素对不同深度DOM分子组成的影响尚不清楚。

本研究的目的是利用开放式顶室(OTCs)模拟增温，阐明增温对高寒草甸土壤DOM的影响。首先用光谱和超高分辨率质谱对DOM的分子组成进行了表征。然后，分别通过高通量测序和气候变暖下土壤理化因子的测量，从生物和非生物因素的角度分析DOM变化的潜在原因。探索DOM随深度对气候变暖的响应对于了解土壤碳库的动态变化具有重要意义。

2. 材料与方法

2.1研究地点和样本收集。

otc通常用于探索生态系统对气候变暖的反应本研究选择对气候变暖极为敏感的青藏高原高寒草甸作为研究区，以OTCs的形式模拟变暖。otc使日平均气温升高0.6 ~ 2.0℃。关于otc的更多信息可在本参考文献中找到采样地点位于中国西北部海北国家级高寒草地生态系统研究站(37°36′38.53″N, 101°18′49.31″E)。

平均海拔3195米，年平均气温- 1.7℃，年降水量426 - 860毫米。在本研究中，于2021年8月初随机收集9个土壤芯，分别作为对照(otc区外土壤)和暖化(otc区内土壤)。土芯深度为0 ~ 80 cm，土芯直径为38 mm。按土层深度分为5层:19 L1、L2、L3、L4、L5，分别对应0 ~ 15、15 ~ 30、30 ~ 45、45 ~ 60、60 ~ 80 cm。共采集土壤样品90份(2 × 9 × 5)。土样通过2mm筛后，装入无菌袋冰运至实验室进行后续实验分析。部分保存在4°C用于测量理化性质，部分保存在- 20°C用于分子实验。

2.2. 理化分析。

利用碳酸氢钠从土壤样品中提取有效磷(AP)，随后通过钼蓝技术进行测量土壤水悬浮液(1:5 w/v)振荡2 h后，用pH计(FE20FiveEasy pH, Mettler Toledo，德国)测定土壤pH。土壤有机质(SOC)和速效氮(AN)分别采用重铬酸钾氧化法和碱扩散法测定。有关水分(MC)、铵态氮(NH4 +−N)、硝态氮(NO3−−N)、TC、总氮(TN)和总磷(TP)测定的进一步详细信息，请参见参考文献26溶解有机碳(DOC)的测量参照参考方案。27

2.3DOM的光谱分析

本研究采用水可提取有机质(WEOM)对土壤DOM特性进行定量分析。值得注意的是，虽然WEOM和DOM在土壤研究中经常交替使用，但WEOM包括容易解吸到水中的有机物，这并不能准确反映土壤中DOM的原位组成，28,29。土壤样品在25±1℃下，土水比1:5 (w/v)振荡24 h, 4200 rpm离心20 min，上清用0.45 μm混合纤维素酯膜过滤，提取DOM。DOM的光谱和质谱分析细节见辅助信息。

2.4. DNA提取，测序和生物信息学分析

使用PowerSoil DNA分离试剂盒(MOBIO实验室，Carlsbad, california USA)从土壤样品中提取DNA，提取过程按照制造商的说明进行。使用Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)和NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, Delaware, USA)对提取的DNA进行浓度和纯度评估，以确保其符合后续分析的要求。选择16s rRNA基因的V3 ~ V4区域进行扩增，分析细菌群落结构，引物为338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。针对真菌ITS区域，采用3f5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′和4r5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′扩增。有关PCR扩增反应的更多细节，请参阅这篇文章PCR产物以等密度比混合，并使用Illumina Nova6000平台(广东Magigene生物技术有限公司，广州，中国)进行高通量测序。OTU表生成于管道网站(http://mem.rcees.ac.cn:8080/)。本研究生成的原始测序数据可在NCBI Sequence Read Archive中查询，登录号为PRJNA901159和PRJNA909495.

2.5. 碳循环相关基因的定量分析

以16S rRNA基因为内参基因，采用基于高通量定量PCR的定量微生物元件循环(QMEC)技术，对32个与碳循环相关的功能基因进行了定量分析，详见本文。31日2.6。数据分析。利用FAPROTAX对分类群进行功能注释，预测和分析细菌群落的功能潜力32，并基于Pearson相关分析进一步探索细菌功能群与DOM组成的关系。包装“radcca”。hp”和UpSetR分别用于变异分区分析(VPA)和分层分区分析(hp)。33,34采用冗余分析(RDA)探讨微生物/环境因素与DOM组成之间的关系。

所有统计分析均使用R版本4.0.4中的“ggplot2”和“vegan”软件包进行。

3.结果

3.1物理化学性质

高寒草甸土壤理化性质随深度变化显著(图S1)。总体而言，对照和增温处理下L1层的pH和C/N值均较低。而其他参数，如NH4 +−N、NO3−−N、TC、TN、TP、DOC、SOC和AN在对照和增温条件下均较高。MC呈现波动趋势。这些结果表明，在对照和增温条件下，沿土壤剖面均存在明显的环境梯度。

3.2. DOM的光谱表征

紫外光谱结果如图S2A和表S1所示。SUVA254值由254 nm处测得的紫外吸光度除以DOC浓度再乘以100计算得到，该值表征DOM腐殖化程度，SUVA254值越大，DOM腐殖化成都越高。增温条件下，SUVA254在L1和L2层呈上升趋势，在L4和L5层呈下降趋势，说明上层腐殖质化程度上升，下层腐殖质化程度下降。L5层的E250/E365比值(250 ~ 365 nm吸收比)从4.667(对照)增加到7.000(升温)。E250/E365比值与DOM的芳香性、腐殖化和分子量呈负相关。这进一步表明增温降低了下层土壤DOM的腐殖化水平。

土样的EEM谱如图1和S2B所示。根据积分荧光面积可将荧光光谱分为5个组分(表S2)。37所有土壤样品主要含有酪氨酸样芳香蛋白、黄腐酸样物质和腐植酸样物质峰(I区、III区和V区)，色氨酸样芳香蛋白峰(II区)较弱。除L4层外，土壤样品中III区和V区荧光强度均增加。同时，L4和L5层的I区(酪氨酸样芳香蛋白)荧光强度在升温下显著降低，说明DOM降解发生在低层(L4和L5)。但增温处理下L3层土壤荧光强度与对照相比变化较小，说明增温对L3层DOM组成影响不大。

除L1层外(图2)，在所有样品中，在3400、1630和900 ~ 700 cm−1附近的区域观察到强烈的波段，分别对应于与醇和酚相关的羟基的拉伸振动，9羧酸盐的芳香振动和C O振动，9和芳香C−H的面外弯曲升温条件下L1层土壤样品的透光率低于对照，说明升温条件下出现了更多的大分子和小分子(图2A)。值得注意的是，在升温后从L5层获得的样品中检测到独特的条带(图2E)，包括1100 - 1000 cm−1的峰，表明脂肪醇和醚同时，L5层在1050 cm−1处也显示出较宽的条带，表明多糖的存在在2957 cm−1处也有一个峰，由于CH3的不对称拉伸，主要属于脂类，少量碳水化合物、蛋白质和核酸这些发现支持了一个结论，即在变暖的情况下，L5层中出现了更多的小分子，如脂质。

3.3. DOM分子的表征

3.3.1DOM分子组成。

为了探索变暖对DOM跨深度分子组成的影响，我们鉴定了独特的和共有的DOM分子。不同深度的共享和独特DOM分子的数量用UpSet图表示(图S3)，以阐明DOM分子组成沿土壤剖面的变化。在对照组中，L3层样品中DOM分子数最多，L1层样品中DOM分子数最少(图S3A)。同时，在升温条件下，L5层样品中DOM分子数最多，L3层样品中DOM分子数最少(图S3D)。在对照组和变暖组中，共有的分子是最大的一组，但其他组则不同。

此外，在变暖条件下，与对照组相比(图S3B,E)共有分子的数量增加。在升温处理下，L5层特有的分子数从361个增加到1387个(图S3B,E)， L1层特有的分子数从306个增加到525个。

这些结果表明，增温对DOM分子组成的影响随土壤深度的不同而不同。样品间排序分析40,41进一步探究了不同深度下DOM分子的差异(图3)。在对照和升温过程中，随着土壤深度的增加，最高排序的含cho分子逐渐从富O (O/C < 0.5)和富dbe化合物转变为贫O (O/C < 0.5)和更高的不饱和度42,43。第一级L4层含CHON的DOM分子表明升温时强度最高，它们在其余层中交替分布(图3B)。

根据C、H、O、N、s的原子组成，可以将分子式分为CHO、CHON、CHONS和CHOS四类，无论它们是处于受控状态还是处于升温状态，每层中都有一半以上的分子属于CHO类，其次是CHON。含硫原子的CHOS和CHONS的比例最低(图S3C,F)。这些结果表明，变暖对不同原子组合比例的影响也较小。

3.3.2. DOM分子组成。

通过VK图分析DOM分子组成的变化(图4)。分子分为三类:“保留”(在控制和变暖中都有识别)，“移除”(仅在控制中有识别)和“产生”(仅在变暖中有识别)。44,45在L3和L4层中观察到“保留”的比例较高，而在L1和L2层中只有两类(“移除”和“产生”)(图4F)。结果表明，表层土壤DOM的动态变化最明显，下层次之，中层对增温的响应相对稳定。具体来说，在L1和L2层中，产生最多的分子是木质素和单宁(图4A,B)。剩下的大部分分子也是木质素和单宁(图4C,D)。易降解组分(如脂类、蛋白质、氨基糖、碳水化合物和不饱和烃)在每层中的含量低于稳定化合物(如木质素和单宁)，因为它们更容易被微生物利用。有趣的是，与L5层“去除”的DOM相比，“生成”的DOM中蛋白质、氨基糖、木质素、单宁和缩合芳烃的相对丰度显著增加，脂类和碳水化合物的相对丰度呈增加趋势(图4E和S4−S6)。同时，DOM质谱显示了观测强度与m/z之间的关系，表明L3层和L4层的分子质量差异不大。而L5层低分子量分子(150 ~ 300 Da)、中分子量分子(300 ~ 450 Da)和高分子量分子(≥450 Da)46增加(图S7)，这与L5层脂质、蛋白质、氨基糖、碳水化合物、木质素、单宁和缩合芳烃增加的结果一致(图4E和S4 ~ S6)。此外，脂质、蛋白质和氨基糖的相对丰度增加，而木质素的相对丰度在L5层呈明显下降趋势(图4G)。基于变化强度、分子组成和分子量的分析结果表明，增温促进了最低层(L5) DOM的降解。增温对中层(L3和L4) DOM组成影响不大，上层(L1和L2) DOM组成变化最明显。

3.4. 生物和非生物因素对DOM分子组成的影响。

光谱学和质谱分析结果表明，增温对上层(L1和L2)和下层(L5)的影响更大，而中层(L3和L4) DOM的动态更为稳定。因此，我们将重点从微生物和环境因子的角度研究增温条件下L1和L5层DOM组成剧烈变化的潜在原因。

研究表明，生物和非生物因素对DOM组成的形成都起着至关重要的作用。3,46在这项工作中，我们使用VPA和HP来研究DOM组成的影响因素(图S8)。环境因素以及细菌和真菌群落结构占DOM组成的81.1%。这三个因素的常见解释比例达到44.15%，细菌和环境因素占29.07%，真菌对DOM的贡献最小。HP结果表明，环境因素对DOM组成的影响最大，其次是细菌，真菌的影响最小。

根据DOM分子被微生物降解的难易程度，DOM可分为不稳定化合物(易被微生物利用)和稳定化合物(不易被微生物利用)两大类具体来说，缩合芳烃、单宁和木质素是稳定化合物(SDOM)，而脂质、蛋白质、氨基糖和碳水化合物是不稳定化合物(LDOM)，便于微生物利用通过RDA分析进一步探讨了环境因素、细菌和真菌对SDOM和LDOM组成的影响。增温条件下的具体结果如下:第一，氮形态(NH4 +−N、NO3−−N)和TC对L1层LDOM和SDOM组成的影响增强;此外，TP对L1层SDOM的影响也有所增强。pH和MC对L5层SDOM组成的影响更大(图5A,D)。其次，Latescibacteria、Bacteroidetes和Verrucomicrobia与L1层LDOM和SDOM组成的相关性增加，而gemmatimonadees和Proteobacteria对L5层LDOM和SDOM组成的影响更大(图5B、E)。最后，L1层升温后，肠菌门、肾小球菌门和Chytridiomycota对LDOM和SDOM组成的影响增大。同时，Mucoromycota、Kickxellomycota和Ascomycota对L1层SDOM的组成也有较大的影响(图5C,F)。此外，Mortierellomycota对LDOM的影响在L1和L5层增强，而Zoopagomycota在升温条件下与L5层SDOM组成的相关性更强(图5C,F)。总体而言，增温条件下，养分含量(氮和碳)对L1层DOM组成的影响较大，pH对L5层DOM组成的影响较大。细菌和真菌对DOM组成的影响具有特异性，特别是在升温条件下。

3.5. DOM与微生物功能电位的联系。

QMEC结果显示，样品中检测到26个功能基因，其中碳降解基因15个，碳固定基因11个。热图显示了控制和升温条件下各层碳循环相关基因的绝对丰度(图S9A)。

结果表明，在控制和增温条件下，与碳循环相关的基因在深度上存在差异。增温使碳循环相关基因的绝对丰度增加，特别是在L2和L3层。L5层α-淀粉酶(amyA)、纤维二糖脱氢酶(cdh)和木质素过氧化物酶(lig) 47基因的绝对丰度在升温条件下显著增加，说明该层微生物在遗传水平上具有降解DOM的潜力。细菌对DOM成分的影响比真菌要大得多 (图S8)。因此，本文只分析了细菌功能在升温条件下DOM组成中的作用。FAPROTAX是环境研究中广泛使用的工具32，用于进一步评估预测函数(图S9B)。通过对细菌群落功能的注释，鉴定出92个官能团，包括与碳/氮/硫循环、能量来源等有关的官能团。高寒草甸土在不同深度剖面上表现出功能差异。有趣的是，在变暖条件下，深层土壤中与碳循环相关的细菌的相对丰度高于表层土壤(图S10A)。细菌功能与DOM组成之间的相关性反映了细菌功能群对DOM的代谢偏好(图6)。研究结果表明，大多数在L1层具有氮循环功能的细菌与蛋白质、氨基糖和碳水化合物呈负相关。同时，大多数具有能源功能的细菌与木质素和单宁呈负相关。这些结果证实，变暖条件下，不稳定的DOM(蛋白质、氨基糖和碳水化合物)可能是氮循环相关细菌的主要碳源，稳定的DOM(木质素、单宁)可能是能量细菌的主要碳源(图6)。此外，不稳定的DOM(脂质、蛋白质、氨基糖、碳水化合物)和稳定的DOM(缩合芳烃)与氮、硫循环功能呈负相关。以及大多数碳循环功能和能量来源，表明大多数细菌可以利用L5层变暖下的冷凝芳烃和小分子。

4.讨论

4.1气候变暖加速了土壤低层DOM的退化。

增温下上层(L1和L2)土壤DOM组成变化明显，下层(L5)次之，中层(L3和L4)相对于上层和下层(图1、2、4和S2)较为稳定。上层土壤中木质素和单宁含量较高(图4A,B,G)。增温作用下，上层(L1和L2) DOM的组成发生明显变化(图4A,B)，这可能是由于上层根系和凋落物更为丰富，为微生物提供了丰富的底物。同时，下层土壤中存在更多的脂质、蛋白质、氨基糖和木质素(图4E、G)。此外，单宁和浓缩芳烃的降解在较低土壤中增强。先前的一项研究表明，变暖对地下土壤碳动态的影响更大。具体而言，升温条件下，土壤中可溶性芳香族化合物(包括单宁和木质素降解产物)减少，土壤中有机碳的降解增加，45这与本研究L5层DOM组成一致。

大量研究发现，在气候变暖的影响下，深根禾草的比例增加，而浅根莎草和草本的比例减少，尤其是细根禾草。48−50这些根深的禾本科植物可以为地下微生物提供新的碳资源。启动效应给微生物带来新的碳输入，使与底土碳循环相关的细菌由休眠向活跃转变，提高了碳的利用，最终促进了底土碳的流失。51此外，据报道，根分泌物中的草酸可以促进矿物质表面有机化合物的释放，这增加了细菌可利用的碳量细菌可以利用复杂的有机化合物，这是细菌应对气候变暖导致的资源限制的策略之一。因此，我们推测这弥补了下层可利用碳的缺乏，导致参与碳循环的细菌相对丰度增加(图S10A)。． 研究还发现，L5层大多数细菌在升温条件下可以利用冷凝芳烃和小分子 (图6)。这些结果进一步表明，升温加速了下层土壤DOM的降解。

此外，中间层(L3和L4)的DOM组成变化虽然不完全稳定，但与上层(L1和L2)和下层(L5)相比相对稳定。我们试图对这一现象提供一个尝试性的解释:首先，中层的外源碳含量不如上层丰富;其次，深根植物的增加是中层微生物的外源碳输入，这可能使激励效果不如L5层明显。

4.2. 微生物在DOM分子组成中的作用

微生物在DOM的产生和消耗中起着至关重要的作用。消耗、转化和形成的同时过程解释了为什么DOM在土壤中持续存在同时，DOM可用性的变化塑造了微生物群落结构和功能，53这是由于微生物对DOM消费的不同偏好。46 .据报道，细菌对DOM组成的贡献大于真菌在我们的研究中，真菌占DOM组成的比例也低于细菌(图S8)。可能的原因是，大多数真菌是致病的、共生的或腐生的，54因此与植物的根密切相关。

细菌代谢偏好和DOM转化可以从DOM分子和细菌分类群之间的相关性推断出来。55,56升温条件下，gemmatimonadees、Proteobacteria和Actinobacteria对L5层LDOM和SDOM的组成影响较大。Gemmatimonadetes通常存在于营养丰富的环境中之前的研究证实，有机物的添加刺激了Proteobacteria和Actinobacteria的生长，这两种细菌是在高C和N效率的环境下茁壮成长的共养类群4，表现出相对较快的生长速度。58−60 Gammaproteobacteria是微生物难以利用的有机物的有效分解者，在L5层变暖的情况下，它们的相对丰度增加(图S10B)。此外，与L1层相比，增温条件下L5层细菌的大部分官能团与脂类、蛋白质、氨基糖、碳水化合物和缩合芳烃呈负相关(图6)，说明增温条件下L5层细菌的主要碳源是缩合芳烃以及小分子化合物。这一结果进一步表明，增温加速了土壤最底层(L5)有机碳的分解。此外，与DOM组成密切相关的优势真菌类群在温度升高的L1层中增加(图5)，这可能是由于种间合作的加强。

4.3. 增温条件下影响L1层和L5层DOM组成的环境因子存在差异

环境因子如TP、TC、TN和ph对DOM组成也有影响[4,62]。在本研究中，升温条件下L1层和L5层DOM组成受环境因子的影响不同。结果表明，增温条件下，氮、碳、磷等养分含量对L1层DOM组成更为重要，pH对L5层的影响更大(图5A、D)。先前的研究表明，随着土壤酸化程度的增加，DOM的组成将变得更加不稳定(脂肪酸和蛋白质的含量更高)升温后L5的pH值降低(图S1)，该层中存在较多的不稳定化合物(如脂类、蛋白质和氨基糖)，说明较低的pH有利于不稳定DOM化合物的存在。因此，可以推断，增温增加了深根植物的生物量，49、50、52和下层植物根系有机酸(L5)增加，导致土壤pH降低，63有利于不稳定DOM的存在。

增温条件下，氮形态(NH4 +−N、NO3−−N)、TC和TP对L1层DOM组成的影响较大(图5A、D)。碳、氮、磷是微生物生存所必需的元素，微生物既可以消耗DOM，也可以产生DOM。与L5层相比，由于存在大量植物根系和凋落物，L1层土壤养分含量(如NH4 +−N、NO3−−N、SOC和DOC)相对丰富。因此，增温条件下养分含量对DOM组成影响较大的一个潜在原因是养分含量通过调节上层微生物活动影响DOM组成。

总之，了解DOM对气候变暖的响应是至关重要的，因为它是土壤碳库的主要组成部分。本研究发现，气候变暖对上层DOM分子组成的影响最大(L1层和L2层产生更多的木质素和单宁)，其次是下层(L5层)，而中层(L3层和L4层)比上层和下层更稳定。值得注意的是，在底土中检测到更多的木质素，而脂质，蛋白质，氨基糖和碳水化合物的相对丰度增加。底土环境的pH值在变暖下下降，变得更酸，有利于小分子(脂类、蛋白质等)的存在。同时，gemmatimonadees、Proteobacteria和放线菌门(Actinobacteria)在地下(L5层)DOM降解中起关键作用。增温条件下，上层(L1)影响DOM组成的优势真菌类群增加。这些结果进一步证实了DOM的分子组成受到微生物组成和土壤环境因素的影响。综上所述，本研究表明高寒草甸DOM对气候变暖的响应是深度依赖的，这为研究气候变暖条件下土壤碳动态提供了新的思路，有助于改进气候变暖条件下土壤碳的建模和预测。植物凋落物的分解是土壤DOM的主要来源。64研究表明，气候变暖增加了陆生植物根系的生物量分配，65气候变暖下地上植被对土壤DOM组成的影响有待进一步研究。此外，为了更好地评估全球土壤DOM对气候变暖的响应，未来的研究还建议考虑海拔、纬度等因素。